Medicina modernă caută în permanență noi tehnologii aplicabile
în diagnosticul, profilaxia și tratamentul bolilor. Între acestea, aplicațiile
biologiei moleculare reprezintă o direcție de viitor, în special în tratamentul
bolilor considerate în prezent incurabile. Medicina translațională aplică noile
descoperiri din cercetările de biologie celulară, moleculară și genetică,
precum și tehnicile rezultate din acestea, pentru terapeutica bazată pe
biologie, care înlocuiește treptat terapeutica bazată pe chimie. De exemplu,
prin aplicarea curentului electric la nivel celular se pot introduce țintit
molecule terapeutice în celulele bolnave sau se poate realiza transfecție de
material genetic.
Electroporarea este electropermeabilizarea membranelor
celulare, care constă în creșterea conductivității electrice și a
permeabilității membranei plasmatice a celulelor, fiind determinată de
aplicarea unui câmp electric extern. Această procedură este utilizată în
special în biologia moleculară, cu scopul de a introduce anumite substanțe
într-o celulă (o sondă moleculară sau un medicament), care pot induce
modificări ale funcțiilor celulare sau de codificare ADN (1).
Electroporarea este un fenomen dinamic, care depinde de voltajul
transmembranar local pentru fiecare punct de la nivelul membranei celulare. În
funcție de tipul și durata impulsului, pragul tensiunii transmembranare permite
manifestarea fenomenului de electroporare. Valoarea-prag a magnitudinii
câmpului electric necesar pentru realizarea fenomenului de electroporare este
cuprinsă între 0,5 și 1 V. Numai celulele aflate în câmp electric mai mare
decât valoarea-prag pot fi electroporate. Dacă este atins sau depășit un
al doilea prag, electroporarea va compromite viabilitatea celulelor, fenomen
numit electroporare ireversibilă (2).
În biologia moleculară, procesul de electroporare poate fi
folosit pentru transformarea celulelor procariote (bacterii) și eucariote
(levuri și protoplaste). Bacteriile care prezintă perete celular alcătuit din
peptidoglicani cu rol de protecție, rezistență și transport al substanțelor
sunt protejate de modificările mediului înconjurător. Pe baza acestei
proprietăți, punerea în contact a bacteriilor cu anumite plasmide poate avea ca
efect transferarea plasmidului în celule bacteriene în urma unui proces de
electroporare, prin aplicarea câtorva sute de volți pe o distanță de câțiva
milimetri. Ulterior, celulele trebuie manipulate cu grijă până când se vor
divide în noi celule care să conțină noile plasmide, acest proces fiind de
aproximativ zece ori mai eficient decât transformarea chimică (3).
Procedeul este foarte eficient pentru introducerea de gene
străine în culturile de celule, în special în liniile celulare de mamifere. De
exemplu, procesul este utilizat la producerea șoarecilor knock-out (șoareci
transgenici la care se inactivează o singură genă-țintă pentru studiul
caracterelor fenotipice codificate de aceasta), precum și în tratamentul
tumorilor, terapia genetică și terapia pe bază de celule. Procesul de
introducere a unor molecule de ADN străine în celule eucariote este cunoscut
sub numele de transfecție. Electroporarea este foarte eficientă pentru
transfecția celulelor în suspensie în mediul de cultivare, folosind cuve de
electroporare. Electroporarea a dovedit eficiență pentru utilizare pe țesuturi in
vivo, pentru aplicații de transfecție in utero sau in ovo.
Celulele aderente pe substrat pot fi, de asemenea, transfectate folosind
electroporarea, oferind astfel cercetătorilor o alternativă pentru tripsinizarea
celulelor înainte de transfecție.
Electroporarea se realizează cu ajutorul electroporatoarelor,
aparate care creează un câmp electromagnetic în suspensia celulară care se
pipetează într-o cuvă de plastic sau sticlă prevăzută cu doi electrozi de aluminiu
pe cele două laturi ale sale.
Pentru electroporarea celulelor bacteriene se folosește o
suspensie de cca 50 µl care se pune în contact, înainte de electroporare, cu
plasmidul de interes. Amestecul se pipetează în cuvă, se setează tensiunea
aplicată și volumul probei, iar cuva este introdusă în electroporator. Imediat
după electroporare, 1 ml de mediu lichid se adaugă în cuvă/tub Eppendorf și se
incubează la o temperatură care să permită multiplicarea bacteriilor, pentru a
recupera celulele și a exprima rezistența la antibiotic, urmată de însămânțare
pe plăci cu agar nutritiv. Pentru ca electroporarea să aibă succes, trebuie ca
plasmidul să fie „free of all salts“, deoarece soluțiile cu concentrație
mare de clorură de sodiu pot provoca o descărcare electrică (arc electric),
fenomen care, de cele mai multe ori, reduce viabilitatea celulei.
Pentru o investigație mai detaliată a procesului, ar trebui să
se acorde atenție impedanței de ieșire a dispozitivului porator și impedanței
de intrare a suspensiei de celule (ex.: conținutul de sare). Deoarece procesul
necesită un contact electric direct între electrozi și suspensie și nu se
produce între electrozi izolați, este evident că procesul presupune existența
unor efecte electrolitice, datorate curenților de intensitate mică și
câmpurilor electrice.
Electroporatoarele sunt echipamente speciale
de laborator care oferă posibilitatea realizării electroporării pentru probe
multiple, în același timp cu ansambluri de electrozi speciali pentru culturi
celulare, cum este sistemul Gemeni X2HT, fabricat de BTX Harvard.
Electroporatoarele pot fi setate pentru diferiți parametri de funcționare, care
să permită cercetătorilor să optimizeze puterea câmpului electric în funcție de
tipul de celule și de prezența sau absența peretelui celular.
Electroporatoarele au fost utilizate pe o gamă largă de celule, inclusiv Escherichia
coli (pentru transformare) și celule de mamifere (neuroni, astrocite,
neuroglii, limfocite, monocite, fibroblaști, celule epiteliale și endoteliale)
de la oameni, șoareci, șobolani și maimuțe (pentru transfecție).
Mecanismele fizice ale electroporării
Electroporarea permite introducerea în celulă a unor molecule de
ADN, care nu au capacitatea de a traversa pasiv membrana celulară (bistratul
lipidic hidrofob). Există mai multe moduri în care se pot produce modificări
ale câmpului electric la nivelul membranei celulare, cu mecanisme și efecte
total diferite. Avantajul electroporării rezidă din faptul că moleculele
lipidice nu sunt alterate din punct de vedere chimic, iar membrana are
capacitatea de a forma un por care va servi drept cale de conducere prin
bistratul lipidic.
Electroporarea este un proces cu mai multe etape și faze
distincte (4). Inițial, trebuie aplicat un impuls electric scurt de 300–400 mV
pentru mai puțin de 1 ms, care determină modificări la nivelul membranei legate
de migrarea ionilor în soluția înconjurătoare. Odată atins domeniul critic, are
loc o rearanjare locală rapidă a morfologiei lipidelor, iar structura rezultată
este considerată a fi un „pre-por“, deoarece nu este bun conducător electric,
dar conduce rapid la formarea unui por conductiv. Cele mai multe dovezi care
vin în sprijinul acestei idei provin de la procesul de „flickering“ care
se produce la nivelul preporilor, cu formarea de regiuni hidrofobe de
aproximativ 3Å (5). Dacă această teorie este corectă, trecerea spre por
conductor ar putea fi explicată printr-o rearanjare la marginea porilor, în
care extremitățile lipidice creează o interfață hidrofilă. În cele din urmă, porii
conductivi pot suferi procese de reorganizare, extindere sau rupere, care pot
fi influențate de diferiți factori locali, cum ar fi punctul și momentul în
care are loc modificarea, stresul mecanic și energia bistratului lipidic
existentă la momentul producerii procesului (6).
Aplicații medicale
Optimizarea condițiilor de electroporare este dificil de
realizat, dar s-a demonstrat că electroporarea cu voltaj ridicat poate distruge
aproape ireversibil celulele-țintă, celulele vecine rămânând neafectate.
Astfel, electroporarea poate constitui o nouă cale terapeutică în tratamentul
cancerului, al bolilor cardiace și al altor stări patologice care necesită
excizii tisulare (7).
O tehnică recentă, numită electroporare ireversibilă
non-termică, s-a dovedit un succes în tratarea diferitelor tipuri de tumori.
Această procedură presupune utilizarea de electrozi mici (aproximativ 1 mm în
diametru), plasați în interiorul sau în jurul țesutului-țintă pentru a aplica
impulsuri electrice scurte, repetitive, la o tensiune și o frecvență
prestabilite, care cresc potențialul de repaus transmembranar. Ca urmare,
atunci când energia electrică aplicată este mai mare decât valoarea-prag pentru
țesutul-țintă, formarea de nanopori în membrana plasmatică poate deveni
permanentă, iar mecanismele de reparare celulară a celulelor canceroase
,,nemuritoare“ devin ineficiente și celulele mor. Procedura este unică,
deoarece, față de alte tehnici de ablație tumorală, nu afectează țesutul
sănătos din jurul tumorii (8).
În contrast, electroporarea reversibilă apare atunci când
energia electrică aplicată prin intermediul electrozilor se află sub
valoarea-prag a câmpului electric al țesutului-țintă. Aplicarea unei energii
electrice sub valoarea-prag permite celulelor să își refacă stratul dublu
fosfolipidic și să își reia funcționarea normală. Electroporarea reversibilă se
realizează în mod normal pentru administrarea de tratamente care presupun
introducerea unor molecule terapeutice (medicamente, gene etc.) în interiorul
celulelor. Deoarece nu toate țesuturile au aceeași valoare-prag a câmpului
electric, sunt necesare calcule precise înainte de începerea unui tratament,
pentru a asigura eficiența administrării.
Un avantaj major al folosirii electroporării ireversibile
non-termice este că, atunci când se face corect, urmare a unor calcule atent
efectuate, aceasta afectează doar țesutul-țintă, în timp ce proteinele,
matricea extracelulară și unele structuri critice, cum ar fi vasele de sânge și
nervii, rămân neafectate după tratament. Acest lucru permite o recuperare mai
rapidă și facilitează o înlocuire mai rapidă a celulelor tumorale necrozate cu
celule sănătoase.
Primul tratament de succes al tumorilor cutanate maligne la
șoareci a fost realizat în 2007, de Garcia și colab., cu ablația completă a
tumorii la 12 din 13 șoareci. Ei au realizat acest lucru prin trimiterea a 80
de impulsuri de 100 µsec la 0,3 Hz, cu o amplitudine a câmpului electric de
2.500 V/cm, pentru a trata tumorile cutanate (8).
Înainte de efectuarea procedurii, terapeutul trebuie să
calculeze cu atenție pașii de urmat și să adapteze terapia pentru nevoile
fiecărui pacient în parte cu ajutorul imagisticii (CT și RMN), pentru a obține
o imagine tridimensională cât mai exactă a tumorii. Această informație este
foarte importantă deoarece astfel se poate aproxima volumul tumorii și decide
asupra tipului de terapie, locului și unghiului de inserție a electrozilor și
tensiunii aplicate uneori chiar în timpul procedurii, mai ales atunci când
electroporarea este utilizată pentru a trata tumorile cerebrale.
Întreaga procedură este rapidă (cca 5 min), rata de succes este
mare și deci foarte promițătoare pentru o viitoare extrapolare a tratamentului
la om. Un dezavantaj ar fi acela că energia electrică eliberată poate stimula
celulele musculare, determinând contracția acestora, lucru care în anumite
situații poate avea consecințe grave sau chiar letale. Prin urmare, trebuie
utilizat un agent miorelaxant (curarizant) în timpul efectuării procedurii.
Cercetările realizate până în prezent au avut succes, dar trebuie acționat sub
rezerva existenței unui risc atunci când se utilizează anestezia generală.
O tehnică recentă, electroporarea ireversibilă de înaltă
frecvență, folosește electrozi pentru a aplica impulsuri electrice bipolare la
o frecvență mare, spre deosebire de impulsurile electrice unipolare la o
frecvență joasă. Acest tip de procedură conduce tot la ablație tumorală, cu
deosebirea că nu produce contracție musculară și de aceea nu este nevoie de un
agent miorelaxant (8).
Cercetătorii au avut succes în tratarea animalelor de laborator
cu mai multe tipuri de tumori. Chiar dacă nu sunt pregătiți pentru a aplica și
utiliza în mod curent această tehnică în tratarea tumorilor la om,
electroporarea ireversibilă non-termică este utilizată în practică pentru a
trata tumorile cutanate și subcutanate. Au existat și tentative pentru a trata
la om cancerul de prostată, plămâni, rinichi și ficat. Mai există încă multe
lucruri care trebuie puse la punct, legate de modul de afectare al animalelor
și, în special, al omului. Kenneth Thompson și colab. au testat siguranța
aplicării acestei tehnici la oameni cu tumori la nivelul plămânilor, rinichilor
și ficatului. Tratamentul s-a dovedit eficient în 71% din cazuri, respectiv la
49 de pacienți din 69 s-a realizat ablația completă a tumorii (9). Rata cea mai
mare de succes a fost înregistrată la tumorile hepatice. Rezultatele acestui
studiu oferă astfel dovezi încurajatoare legate de utilizarea în viitor a
acestei tehnologii ca o metodă alternativă de tratare a cancerului la om.
Electroporarea poate fi utilizată și pentru introducerea de
medicamente sau gene în celule țintă, prin aplicarea unor impulsuri electrice
scurte și intense care să permeabilizeze tranzitoriu membrana celulară. Această
procedură este denumită electrochimioterapie, când moleculele care trebuie
transportate sunt reprezentate de un agent chimioterapic, sau electrotransfer
de gene, când molecula transportată este reprezentată de material genetic
(ADN).
Aplicații farmaceutice
Unele companii farmaceutice au realizat studii pentru
dezvoltarea procedurilor de electroporare cu aplicații medicale, cu scopul de a
oferi o alternativă viabilă absorbției unor medicamente la nivel celular.
Această abordare se bazează pe faptul că celulele umane nu permit intrarea
liberă a unor elemente străine prin membrana celulară, fapt care are ca
rezultat întârzierea eficienței administrării unui medicament. De aceea,
electroporarea poate constitui o soluție reală care să permită unui medicament
să acționeze direct, rapid și cu maximă eficiență asupra celulelor și
țesuturilor care necesită tratament, rezultatul fiind obținerea unui efect
terapeutic bun, fără efecte secundare majore. De exemplu, Inovio și OncoSec au
testat eficiența acestei tehnologii și au reușit, în 2013, să realizeze pași
importanți în această direcție. Rezultatele le-au permis și obținerea de
câștiguri substanțiale: Inovio Pharmaceuticals a avut creșteri ale profitului
de aproape 500%, iar OncoSec Medical de 150%. Inovio realizează studii folosind
vaccinuri sintetice, în timp ce OncoSec testează agenți terapeutici deja
utilizați în tratamentul cancerului.
Au fost dezvoltate aproximativ douăsprezece tratamente prin
electroporare de Inovio, pentru tratamentul cancerului și al bolilor infecțioase.
Astfel, testele realizate pe vaccinul gripal H1N1 au evidențiat răspuns imun
protector comparabil cu vaccinurile convenționale. De asemenea, vaccinul SynCon
DNA a determinat protecție totală față de infecția cu virusurile febrelor
hemoragice Ebola și Marburg. Studiile preliminare pentru ambele tipuri de
vaccin, deși sunt în faza inițială, arată că acestea prezintă un puternic efect
împotriva răspândirii acestor virusuri mortale. În 2014, compania a anunțat că
vaccinul experimental H7N9 a generat anticorpi hemaglutinanți protectori la
100% din animalele testate. Tot în 2014, compania amintită a anunțat că
electroporarea îmbunătățește semnificativ rezultatele terapiei ADN, în sensul
stimulării multiplicării elementelor sanguine. La rândul său, OncoSec a realizat
studii preclinice pentru tratarea melanomului metastatic, a carcinomului cu
celule Merkel (MCC) și a limfomului cutanat cu celule T. În studiu au fost
incluși 15 pacienți cu MCC, iar până în prezent platforma de electroporare a
companiei s-a dovedit a fi sigură, la ultima verificare toți pacienții
prezentând o creștere a absorbției IL-12 de cel puțin o sută de ori (în unele
cazuri, de până la o mie de ori). Acest fapt oferă speranță în ceea ce privește
reducerea efectelor secundare care apar ulterior imunoterapiei. De asemenea, au
fost realizate studii pe melanom la un grup de 25 de pacienți. Au fost
raportate fișele complete pentru 21 dintre aceștia și s-a observat că 38,1% au
prezentat răspuns complet favorabil pe o durată mai mare de șase luni, iar la
61,1% din pacienți s-a observat și o regresie a tumorii de 30%.
Se consideră că viitorul apropiat va aduce o serie de noutăți în
acest domeniu, cum ar fi: extinderea studiilor și obținerea unor rezultate
pozitive, pentru mai mult decât populații mici de pacienți; raportarea datelor
studiului de fază 2 pentru VGX-3100 în tratamentul displaziei de col uterin (în
faza 1 a demonstrat răspuns imun bun); raportarea datelor finale ale studiului
pentru melanom și pentru carcinomul cu celule Merkel; prezentarea planurilor de
lansare pentru un studiu de tratare a limfomului cutanat cu celule T, dar și a
celor de inițiere a unei noi cercetări pentru tratarea de tumori solide;
combinarea dispozitivul de electroporare cu anti-CTLA4, anti-PD-1 și anti-PD-L1
(în mod special anti-PD-L1s) a fost printre cele mai des discutate potențiale
terapii ale cancerului după ce două companii farmaceutice au raportat date
promițătoare la congresul Societății americane de oncologie clinică (ASCO).
Toate acestea au condus la ideea că electroporarea poate crește asimilarea unor
agenți terapeutici, scăzând totodată efectele secundare ale acestora și
crescându-le eficiența.
Concluzii
Electroporarea terapeutică este o tehnologie nouă pentru
tratamentul la nivel celular, in vivo. Metoda se bazează pe
electroporarea membranei celulare, care devine permeabilă selectiv pentru
agenții terapeutici utilizati. Experimentele in vitro și in silico
sunt promițătoare și au permis introducerea de molecule chimice și biologice în
celulele-țintă. Experimentele in vivo pe animale de experiență au dat
rezultate terapeutice bune, deci în viitor ar putea fi aplicate și la om.
Electroporarea terapeutică poate să devină, în viitorul
apropiat, un tratament important pentru bolile oncologice, cardiace, infecțioase
etc., prefigurând perspectiva predominant biologică a terapeuticii în medicina
modernă.
