Pirosecvențierea. Tehnica Roche 454 sau
pirosecvențierea, asemănător cu metoda Illumina, secvențiază concomitent
multiple fragmente, prin înregistrarea semnalelor optice pe parcurs ce bazele
nucleotidice sunt adăugate. Probele ADN sau ARN sunt fragmentate în secvențe
scurte, dar, spre deosebire de Illumina, mult mai mari, de până la 1.000 de
perechi de baze. Secvențele adaptor sunt adăugate la capete și apoi prin
intermediul lor fragmentele de ADN se atașează la nivelul suportului fizic unde
va avea loc procesul de amplificare. Secvențierea se realizează pe un suport
PicoTiterPlate prin adăugarea de nucleotide. Componentele reacției sunt
fragmentele de ADN, tamponul de reacție și patru enzime: ADN-polimeraza care
încorporează nucleotidele, ATP-sulfurilaza care convertește PPi-pirofosfatul în
ATP în prezența adenozin-5-fosfosulfat, luciferaza care oxidează luciferina în
prezența ATP și generează lumină și apiraza care degradează nucleotidele
neincorporate și excesul de ATP. La final se generează cromatograme pentru
fiecare secvență citită, ce arată intensitatea semnalului luminos pentru
fiecare adăugare de nucleotid. Secvența se determină ulterior computațional din
intensitatea semnalului.
Secvențierea Ion torrent. Spre
deosebire de Illumina și 454, Ion torrent sau Ion proton nu folosește semnalele
optice, ci eliberarea de H+ după adiția unui dNTP. Schimbările de
pH, dacă sunt prezente determină câte baze s-au adăugat după fiecare ciclu.
Principalele avantaje ale tehnicilor de nouă generație (NGS), față
de secvențierea Sanger, sunt: rapiditatea, dimensiunea probelor, costul și
acuratețea. Tehnicile NGS sunt semnificativ mai rapide, mai ieftine, necesită o
cantitate mică a probei ADN și sunt mai precise comparativ cu secvențierea
clasică.
În metoda Sanger sunt necesare fragmente multiple de ADN pentru
fiecare bază nucleotidică secvențiată. Tehnicile NGS sunt rapide pentru că reacțiile
chimice sunt combinate cu detecția semnalului. În Sanger, aceste două procese
sunt separate și, mai mult decât atât, numai o citire de maximum 1.000 de
perechi de baze poate fi analizată odată, spre deosebire de NGS, unde secvențierea
este paralelă, permițând citirea a 300 Gb la un singur ciclu, pe un singur cip.
Astfel, costul a fost redus considerabil. Dacă secvențierea primului genom uman
prin metoda Sanger a costat trei miliarde de dolari, în prezent, costul s-a
redus la o mie de dolari*.
Având toate acestea în vedere, ce se poate realiza astăzi cu
noile tehnici de secvențiere? Care sunt descoperirile aduse de NGS în medicină și
care este aplicabilitatea lor în diagnosticul și/sau tratamentul unor patologii
umane? Aduc acestea numai avantaje sau analizarea lor necesită precauție în
traducerea semnificației biologice a polimorfismelor evidențiate de secvențierea
genomică? Răspunsurile – într-un număr viitor.
