Autentificare

Dacă ești abonat medichub.ro, autentificarea se face cu adresa de E-mail și parola pe care le utilizezi pentru a intra în platformă.
Abonează-te la „Viața medicală” ca să ai acces la întreg conținutul săptămânalului adresat profesioniștilor din Sănătate!
#DinRecunostinta

Căutare:

Căutare:

Acasă

Metode de secvențiere genetică (2)

Viața Medicală
Dr. Nicoleta-Monica FOTEA vineri, 25 martie 2016
     Secvențierea prin sinteză sau tehnologia Illumina pornește de la fragmentarea ADN în secvențe de 200–600 de perechi de baze. Fragmentarea este realizată de transpozom (complex transpozon–transpozază), care taie ADN dublu catenar. Transpozomul* este utilizat în mutageneza inserțională și este o secvență ADN cu capete libere care se inserează în ADN de interes, la întâmplare, printr-un mecanism de „copy & paste“. Pentru că transpozomul are capete libere, realizează atât fragmentarea, cât și adăugarea de secvențe necesare pentru amplificare și secvențiere. De o parte și de alta a fragmentelor rezultate se atașează secvențe denumite adaptor cu rol în etapa următoare, de amplificare.
 
 
 
Etapa de fragmentare și amplificare
(adaptat după Illumina Sequencing)
 
     În timpul etapei de amplificare se adaugă secvențe: index, terminale și complementare primerilor. Indexul este o secvență de șase perechi de baze folosită pentru a identifica fragmentul de-a lungul experimentelor. Astfel, se pot folosi aproximativ o sută de fragmente simultan, fiecare având un index diferit. La final, sistemul de analiză computerizată va grupa toate citirile bazându-se pe index. Secvența terminală se folosește pentru atașarea fragmentului de ADN la nivelul plăcii de sticlă – denumită flow-cell. Pe sticla acoperită cu acrilamidă se găsesc oligonucleotide complementare regiunii terminale. Odată ce fragmentul ADN este adăugat pe flow-cell, acesta se va atașa la oligonucleotidul complementar. Astfel, aceste oligonucleotide mențin ADN la nivelul platformei în timpul secvențierii.
     Odată atașat, urmează etapa de amplificare de tip punte („bridge“) a catenelor de ADN cu scopul de a crea sute de copii ale catenelor originale și ale celor complementare. ADN polimeraza sintetizează catena complementară celei inițiale, pentru ca mai apoi aceasta din urmă să fie spălată. Catena nou sintetizată are la capătul său un adaptor ce determină curbarea catenei pentru a intra în contact cu oligonucleotidul complementar. Polimeraza se atașează la nivelul catenei complementare și resintetizează catena originală. Această amplificare de tip punte se desfășoară simultan pentru sute de mii de clustere în același timp.
     La finalul amplificării, catenele complementare sunt spălate, rămânând numai cele originale. Primerii se vor atașa la această catenă ADN și mai apoi sunt adăugate nucleotidele fluorescente. Fiecare nucleotid conține o secvență finală ce împiedică adiția mai multor nucleotide în același timp. După fiecare adiție, aparatul va detecta tipul de nucleotid după lungimea de undă specifică fiecărui fluorocrom atașat. După citirea catenei ADN originale, catena nou formată este spălată, primerul indexului 1 este adăugat și polimerizează cu secvența index 1, pentru ca ulterior aceasta să fie îndepărtată, fapt ce duce la deblocarea capătului 3’OH, curbarea catenei și atașarea la oligonucleotidul complementar. Primerul indexului 2 se atașează, polimerizează cu secvența index 2 și este spălat pentru ca ADN-polimeraza să construiască catena complementară. Cele două catene rezultate sunt separate, capătul 3’OH este blocat și catena originală îndepărtată. Catena complementară va urma același proces de secvențiere prin sinteză ca și cea originală.
Etapa de amplificare de tip punte (bridge)
 
     Analiza datelor se bazează pe gruparea fragmentelor ce se suprapun, având în vedere că secvențierea se realizează în milioane de clustere, fiecare conținând una-două mii de copii ale ADN-ului introdus. Întrucât fragmentele în tehnica Illumina sunt scurte, regiunile de tip short tandem repeats (STR) nu pot fi identificate cu ușurință. De asemenea, dacă secvența ADN este nou descoperită și nu există o referință pentru comparare, reconstruirea devine dificilă. Un alt dezavantaj al metodei este utilizarea ADN-polimerazei, care poate introduce nucleotide greșite mai ales la nivelul capetelor 3’OH, ceea ce generează secvențe incorecte.

 

 

 

*Hoffman LM et al. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 2000;108(1):19-24

Abonează-te la Viața Medicală

Dacă vrei să fii la curent cu tot ce se întâmplă în lumea medicală, abonează-te la „Viața medicală”, săptămânalul profesional, social și cultural al medicilor și asistenților din România!
Avem două tipuri de abonamente anuale:
• Tipărit + digital – 200 de lei
• Digital – 129 lei

Prețul include TVA și taxele poștale de expediere a ziarului.
Titularii abonamentelor pe 12 luni sunt creditați astfel de:
• Colegiul Medicilor Dentiști din România – 5 ore de EMC
• Colegiul Farmaciștilor din România – 10 ore de EFC
• OBBCSSR – 7 ore de formare profesională continuă
• OAMGMAMR – 5 ore de EMC