Imunohistochimia (IHC) este o metodă de evidențiere și
localizare a antigenelor celulare sau tisulare, de la aminoacizi sau proteine
până la agenți infecțioși și populații celulare specifice. Deși este mai puțin
sensibilă din punct de vedere cantitativ, comparativ cu celelalte metode
imunologice precum ELISA sau Western blot, permite observarea fenomenelor
într-un țesut intact, extrem de utilă mai ales în stadializarea unor tipuri de
cancere, precum limfoamele, sau la diferențierea leziunilor maligne de cele
benigne (1). Punerea în evidență a antigenelor în IHC se face prin utilizarea
unor anticorpi ce recunosc situsul antigenic; cum anticorpii au specificitate
înaltă, aceștia se vor lega numai de antigenul cercetat. Reacția
antigen-anticorp este apoi vizualizată folosind fie detectarea cromogenă, în
care o enzimă conjugată la anticorp clivează un substrat pentru a produce un
precipitat colorat, fie detecția cu fluorescență, în care un fluorocrom este
conjugat la un anticorp ce va fi vizualizat la microscopia cu fluorescență. În
IHC se descriu trei etape: pregătirea lamelor (fixarea probelor și pregătirea țesuturilor);
reacțiile imunologice specifice; interpretarea și cuantificarea expresiei
antigenului în țesuturile investigate.
În etapa inițială se pregătesc secțiunile tisulare prin fixare
în formaldehidă și includere la parafină. Pentru aceasta, țesuturile ce urmează
a fi analizate sunt secționate cu o grosime mai mică de 3 mm și fixate într-o
soluție de paraformaldehidă 2% pe o durată variabilă ce diferă în funcție de
țesutul analizat și protocolul urmat. Ulterior, țesutul se spală cu apă
distilată pentru cinci minute și se deshidratează la trecerea prin soluții de
etanol având concentrații crescătoare (de la 70, 80, 95 la 100%). Clarificarea
țesutului se face cu xilen, alcool izopropilic, alcool amilic, benzen sau alte
substanțe de acest tip. Urmează apoi imersia și includerea într-un bloc de
parafină. Țesutul astfel parafinat poate fi păstrat ani de zile la temperatura
camerei. Blocul de parafină este secționat la o grosime de 5 μm și se scufundă
într-o baie cu apă distilată la 40°C. Secțiunile obținute se etalează pe lamă
și se vor usca cel puțin peste noapte înainte de imunocolorare.
Țesut cerebral de șoarece colorat prin imunohistochimie ABC
În a doua etapă urmează imunocolorarea propriu-zisă. Lamele cu
țesutul de investigat se vor deparafina în xilen și rehidrata prin trecerea
succesivă pentru cinci minute prin soluții de etanol de concentrații
descrescătoare (de la 100 la 95, 70, 50%). Urmează etapa de blocare a
activității peroxidazei endogene prin incubarea într-o soluție de peroxid de
hidrogen 3% – metanol pentru zece minute la 24°C și spălarea cu soluție salină
tamponată cu fosfat (PBS). Apoi, pasul de evidențiere a antigenului este extrem
de important în cazul secțiunilor incluse la parafină și se realizează frecvent
cu tampon citrat (pH 6,0), incubatîn
funcție de indicațiile producătorului. Apoi se realizează blocarea situsurilor
nespecifice cu un agent de blocare (de exemplu 10% ser fetal bovin în PBS) a
enzimelor și a biotinei endogene. Deși anticorpii au o aviditate preferențială
pentru anumiți epitopi, aceștia se pot atașa slab și la alte proteine nespecifice,
ale căror situsuri reactive sunt similare cu cele ale proteinelor țintă.
Legarea nespecifică creează un background puternic care maschează detectarea
antigenului căutat. După blocarea atașării nespecifice, anticorpii primari
diluați corespunzător sunt adăugați peste secțiuni și incubați într-o cameră
umedă la 24°C timp de o oră. Se spală cu PBS de două ori și se incubează 30 de
minute cu anticorpii secundari biotinilați diluați. Anticorpii secundari pot fi
nebiotinilați, însă adăugarea acestei molecule permite o amplificare a
semnalului și implicit o sensibilitate mai înaltă. Diluarea anticorpilor
primari și secundari este o altă metodă care urmărește eliminarea colorării
nespecifice a backgroundului. În continuare, dacă se utilizează o metodă imunoenzimatică,
se incubează enzima atașată la avidină sau streptadvidină împreună cu
substratul pentru a genera un precipitat ce va fi vizualizat la microscopia
optică, iar dacă se optează pentru metoda imunofluorescentă, se incubează un
conjugat conținând un fluorocrom atașat la avidină sau streptavidină cu
detectare prin microscopie cu fluorescență. Opțional, lamele se pot
contracolora cel mai frecvent cu hematoxilină, Hoechst sau DAPI. Se
rehidratează în soluții de alcool etilic de concentrații crescânde, se
clarifică cu xilen și se montează. Din etapele descrise reiese că există mai
multe modalități de imunocolorare; cele mai cunoscute și utilizate metode sunt
descrise pe scurt în continuare.
Metoda directă este o colorare într-un singur pas și implică un
anticorp marcat care interacționează direct cu antigenul din țesuturi. Este o
tehnică rapidă și simplă, care utilizează un singur anticorp, dar cu o
sensibilitate redusă din cauza amplificării reduse a semnalului; este rar
utilizată în prezent, după introducerea metodei indirecte.
Metoda indirectă implică un anticorp nemarcat care
interacționează cu antigenul tisular și un anticorp secundar marcat care se
leagă la anticorpul primar. Este o metodă mai sensibilă datorită amplificării
semnalului prin reacțiile anticorpului secundar cu diferitele situsuri
antigenice ale anticorpului primar. Este de specificat că anticorpul secundar
trebuie să fie îndreptat împotriva anticorpului primar și pentru aceasta să fie
obținut de la o specie diferită de cea în care s-a obținut anticorpul primar
(de exemplu, dacă anticorpul primar este de șoarece, cel secundar este obținut
la o specie diferită – iepure, oaie, maimuță). Pe lângă sensibilitatea mai
înaltă, este și o metodă economică pentru că același anticorp secundar marcat
poate fi folosit pentru mai multe tipuri de anticorpi primari cu situsuri
antigenice diferite. Anticorpul secundar poate fi marcat fluorescent cu
rhodamină, FITC, Texas Red definind metoda imunofluorescentă indirectă sau
poate fi marcat enzimatic cu peroxidază, fosfatază alcalină sau
glucozo-oxidază, metodă denumită imunoenzimatică indirectă.
Metoda peroxidază–antiperoxidază este dezvoltată plecând de la
metoda indirectă și utilizează un al treilea strat, un anticorp antiperoxidază,
formând un complex mai stabil peroxidază–antiperoxidază. Sensibilitatea este de
aproximativ o mie de ori mai mare pentru că peroxidaza nu este legată de
anticorp chimic, ci imunologic și astfel nu își diminuează activitatea
enzimatică. Aceasta permite și o diluție mai mare a anticorpilor primari, cu
reducerea consecutivă a backgroundului nespecific.
Metoda ABC (cu complexul avidină–biotină) este o metodă
standard, în trei straturi. Utilizează avidina, o glicoproteină cu greutate
moleculară mare, care se marchează cu peroxidază sau fluoresceină și are o
afinitate mare pentru biotină. Biotina, vitamină cu greutate moleculară mică,
este conjugată cu o varietate de anticorpi secundari. Primul strat este
reprezentat de anticorpii primari nemarcați, al doilea este un anticorp secundar
biotinilat, iar al treilea implică complexul avidină–biotină–peroxidază.
Peroxidaza determină o reacție colorimetrică prin acțiunea asupra unui substrat
ca 3-3’-diaminobenzidină.
Metoda complexului strepavidină–biotină marcată. Streptavidina,
derivată din Streptococcus avidini, este un substituent al avidinei.
Aceasta este o moleculă neutră, neîncărcată electric, spre deosebire de
avidină, eliminând astfel atașarea electrostatică. De asemenea, streptavidina
nu are grupări carbohidrat care să se lege la lectine și să coloreze
backgroundul. Este o metodă în trei straturi, ca metoda ABC. Primul strat este
format de anticorpul primar nemarcat, al doilea este anticorpul secundar
biotinilat, iar al treilea, conjugatul enzimă–streptavidină, care înlocuiește complexul
avidină–biotină–peroxidază. Reacția este ulterior vizualizată prin aplicarea
unui substrat reprezentat de o soluție cromogenă. Al treilea strat poate fi și
streptavidină marcată fluorescent. Metoda strepavidină–biotină marcată este,
conform unor studii, de cinci-zece ori mai sensibilă decât metoda ABC (2).
Etapa finală, de interpretare, se face de cele mai multe ori
calitativ și subiectiv, neexistând sisteme standardizate de cuantificare a
pozitivării reacțiilor. Atunci când funcția unor markeri și distribuția lor
este cunoscută, interpretarea rezultatului IHC este relativ mai simplă
comparativ cu situația în care funcția markerului este incomplet cunoscută sau
distribuția sa depinde de subcompartimentul celular în care se găsește (1).
Notă autor:
Bibliografie
1. Matos LL et al. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 2010 Feb 9;5:9-20
2. Rajendran A, Sivapathasundharam B. Shafer’s Textbook of Oral Pathology. Elsevier Health Sciences APAC, 2014
Abonează-te la Viața Medicală!
Dacă vrei să fii la curent cu tot ce se întâmplă în lumea medicală, abonează-te la „Viața Medicală”, publicația profesională, socială și culturală a profesioniștilor în Sănătate din România!
Cookie-urile ne ajută să vă îmbunătățim experiența pe site-ul nostru. Prin continuarea navigării pe site-ul www.viata-medicala.ro, veți accepta implicit folosirea de cookie-uri pe parcursul vizitei dumneavoastră.
