CRISPR/Cas, o nouă modalitate de editare a genomului ce poate modifica
ADN-ul cu înaltă acuratețe, a fost prezentată în 2012 de cercetători de la Universitatea
Berkeley din California. Dar, de fapt, istoria CRISPR este mult mai veche și reprezintă
o reîntoarcere la un sistem descris pentru prima dată de o echipă japoneză condusă
de Izumi Ishio (1). Japonezii descriu scurte secvențe palindromice de ADN despărțite
de secvențe spacer non-repetitive la Escherichia coli; denumirea actuală
de CRISPR, abreviere de la „clusteres regularly interspaced short palindromic
repeats“, îi aparține lui Ruud Jansen încă din 2002 (2).
În 2007, Rodolphe Barrangou (3) arăta că CRISPR, prin asociere cu
proteinele Cas, conferă imunitate bacteriilor împotriva virusurilor prin compararea
ADN-ului încorporat în secvențele spacer cu ADN-ul viral. Secvențele repetitive
de ADN împreună cu proteinele Cas asociate și moleculele de ARN au fost denumite
sistemul CRISPR/Cas.
Sistemul CRISPR/Cas are un rol important în imunitatea bacteriană.
În momentul în care o bacterie întâlnește o sursă de ADN, care poate fi un virus,
aceasta poate incorpora și copia segmente din ADN-ul viral în propriul genom ca
spaceri între secvențele palindromice din CRISPR. Acești spaceri stimulează imunitatea
bacteriană pentru că reprezintă secvențele template pentru moleculele de
ARN care vor identifica rapid aceeași secvență de ADN în eventualitatea în care
va fi infectată cu același virus. Atunci când moleculele de ARN recunosc o secvență
de ADN, acestea ghidează complexul CRISPR/Cas către acea secvență. Proteinele Cas
bacteriene – a nu se confunda cu sistemul de caspaze specializate în tăierea ADN-ului
– distrug genele virale. În 2012, Jennifer Doudna și Emmanuelle Charpentier au prezentat
un sistem CRISPR/Cas9 cu un ARN hibrid care putea fi programat pentru a identifica,
tăia și chiar înlocui orice secvență genică (4). Din 2012, numărul de articole în
care este citată tehnica CRISPR/Cas9 a crescut exponențial (figura).
De ce este CRISPR/Cas atât de special? Principalul avantaj al sistemului,
spre deosebire de celelalte metode de editare genomică, precum cea a nucleazelor
cu domenii de zinc sau TALENs („Transcription activator-like effector nucleases“),
este simplitatea în utilizare. Ambele sisteme menționate necesită ca în prealabil
să fie create proteinele pentru fiecare dintre genele vizate, o etapă consumatoare
de timp.
CRISPR/Cas9 poate fi utilizat în orice tip de celule, până acum în
literatură fiind menționate celule de șoarece, maimuță, broască, dar și celule stem
umane sau celule ale sistemului imun. Încă din 2013 s-a testat capacitatea de adaptare
a CRISPR/Cas în editarea genomului uman. Cong (5) a arătat că acest sistem poate
fi transfectat în celule sub formă de plasmide care să includă un promoter adecvat
pentru a promova expresia celulară și că aceste componente se pot asambla în celulele
transfectate. De asemenea, s-a demonstrat că CRISPR poate să modifice eficient genomul
țintit, atât în cazul locusurilor endogene, cât și la nivel de gene reporter (gene
adăugate pentru detectare, identificare sau selecție) prin recombinare omoloagă
sau non-omoloagă. Același grup a arătat că se pot muta două gene simultan și că
eficiența de modificare a genomului este mai mare comparativ cu TALENs.
Cas9 creează o discontinuitate în molecula de ADN dublu catenar acolo
unde nu există legătură fosfodiesterazică, mai degrabă decât o fragmentare. Avantajul
discontinuității față de fragmentare este că permite repararea mutației cu o frecvență
mai mare prin recombinare omoloagă. Minimizarea recombinării non-omoloage în favoarea
celei omoloage crește siguranța metodei și o face mai fezabilă pentru terapia genică.
Problema care se pune atunci când se vorbește despre un sistem bazat
de nucleaze este afectarea unor gene care nu sunt ținta terapiei, pentru că mutațiile
punctiforme sau rearanjamentele cromozomiale pot să predispună o celulă la transformare
malignă. Specificitatea CRISPR se pare că nu este determinată de întreaga sa secvență,
ci de o regiune de 12–14 perechi de baze, ceea ce înseamnă că, odată ce regiunea
genomică ce trebuie să fie recunoscută de CRISPR este mai scurtă, probabilitatea
apariției de mutații în regiuni nedorite este mai mare. Elucidarea modalității în
care un sistem prokariot reacționează în momentul în care este introdus în cel
al mamiferelor este esențială pentru a anticipa modul în care vor fi țintite unele
locusuri genetice.
Între 2012 și 2016 au fost explorate diferite aplicații ale metodei,
de la identificarea genelor cu potențial în oncogeneză (6) la eradicarea infecției
latente HIV-1 (7) și, cel mai recent și controversat, la modificarea genomului uman.
În aprilie 2015, echipa condusă de Huang (8) a injectat sistemul CRISPR/Cas9 la
embrioni umani, plecând de la ideea că, dacă se înlocuiește o genă în embrionul
uman cu o singură celulă, atunci, în principiu, toate celulele rezultate din embrion
o să conțină noua genă. Embrionii utilizați de aceștia au fost obținuți de la o
clinică de fertilizare și aveau un set suplimentar de cromozomi, prin fertilizarea
lor de către doi spermatozoizi. Au fost urmărite genele HBB, care codifică β-globulina
și care prin mutații duc la β-talasemie. 86 de embrioni au fost injectați și s-a
așteptat 48 de ore pentru a permite CRISPR/Cas9 să înlocuiască gena și pentru ca
embrionul să ajungă la stadiul de opt celule. Din cei 71 de embrioni care au supraviețuit,
54 au fost testați genetic și numai 28 dintre ei au avut gena deletată, iar înlocuirea
genei anormale cu cea normală a fost înregistrată la și mai puțini embrioni. Drept
urmare, echipa chineză a întrerupt cercetarea spunând că este încă prematur pentru
ca aceasta să fie utilizată la embrionii umani. Mai mult decât atât, s-a observat
că numărul de mutații în zone nevizate a fost mult mai mare comparativ cu studiile
făcute pe embrioni de șoarece sau pe celule umane mature.
Deși frecvent criticată această inițiativă, revista Nature
a refuzat articolul pe motive etice, pentru ca în final studiul să apară în Protein
& Cell. Huang și-a justificat cercetarea și articolul susținând că este
mai bine să se cunoască efectele CRISPR pe embrioni umani din studii propriu-zise
decât din supoziții. Aceeași echipă lucrează la îmbunătățirea tehnicii prin introducerea
enzimelor sub o formă diferită pentru a le inactiva înainte ca mutațiile să se acumuleze
și prin optimizarea enzimelor pentru a le ghida mai exact în locusul dorit.
Notă autor:
Bibliografie
1. Yoshida KI et al. Organization and transcription of the myo-inositol operon, iol, of Bacillus subtilis. J Bacteriol. 1997 Jul;179(14):4591-8
2. Jansen R et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol. 2002 Mar;43(6):1565-75
3. Barrangou R et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 2007 Mar 23;315(5819):1709-12
4. Jinek M et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21
5. Cong L et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013 Feb 15;339(6121):819-23
6. Chen S et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 2015 Mar 12;160(6):1246-60
7. Hu W et al. RNA-directed gene editing specifically eradicates latent and prevents new HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Aug 5;111(31):11461-6
8. Liang P et al. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 2015 May;6(5):363-72
Abonează-te la Viața Medicală!
Dacă vrei să fii la curent cu tot ce se întâmplă în lumea medicală, abonează-te la „Viața Medicală”, publicația profesională, socială și culturală a profesioniștilor în Sănătate din România!
Cookie-urile ne ajută să vă îmbunătățim experiența pe site-ul nostru. Prin continuarea navigării pe site-ul www.viata-medicala.ro, veți accepta implicit folosirea de cookie-uri pe parcursul vizitei dumneavoastră.