Cultura
celulară este procesul prin care celulele sunt crescute în condiții controlate,
cel mai frecvent în afara mediului natural. Condițiile de cultivare diferă în
funcție de tipul celular, dar, în general, acestea sunt un substrat-placă cu
mediu care furnizează nutrienții necesari creșterii și un incubator care
reglează caracteristicile fizico-chimice (pH, presiune, concentrație de CO2,
presiune osmotică și temperatură). Deși cele mai multe tipuri celulare necesită
un substrat de care să adere, denumite culturi monostrat sau culturi aderente,
alte tipuri cresc flotând liber în mediu (culturi în suspensie).
Celulele
pot fi îndepărtate din țesutul inițial direct sau prin metode enzimatice sau
mecanice înainte de cultivare sau pot fi derivate din linii celulare deja
stabilite.
Cultura
primară reprezintă etapa ulterioară izolării și proliferării
în condiții optime până când aceasta ocupă întreg substratul (cultură celulară
la confluență). În această fază, celulele trebuie subcultivate (pasate) prin
transferarea lor pe un nou substrat cu mediu proaspăt, pentru a asigura spațiul
necesar multiplicării. Primele subculturi care derivă din cultura primară au o
durată de viață scurtă (trei-cinci cicluri), dar, pe parcursul pasajelor, sunt
selectate celulele cu cea mai mare capacitate de diviziune, dând naștere astfel
unei populații uniforme din punct de vedere genotipic și fenotipic, denumită linie
celulară. Deși liniile celulare sunt mai frecvent utilizate datorită
facilității și reproductivității, reprezintă opțiuni mai puțin relevante din
punct de vedere biologic pentru că se îndepărtează funcțional și morfologic de
cele din țesutul original. O tulpină celulară este o subpopulație a unei
linii celulare care a fost selectată prin diferite metode, aceasta având
adeseori modificări genetice adiționale față de linia parentală.
Celulele
normale se divid de un număr limitat de ori înainte de a-și pierde capacitatea
de proliferare, proces determinat genetic și cunoscut sub numele de senescență.
Aceste tipuri de celule alcătuiesc culturi finite. Prin procesul de
transformare, spontan sau indus, unele linii celulare devin imortale, ceea ce
presupune capacitatea de a multiplica la infinit, denumite linii celulare
continue.
Celulele
în cultură pot fi clasificate în funcție de multiple caracteristici. Din punct
de vedere morfologic există trei mari tipuri celulare: fibroblaste – celule
bipolare sau multipolare, cu formă alungită, care cresc prin atașare la
substrat; celule epiteliale – celule poligonale cu dimensiuni regulate, care
cresc în grupuri prin atașare la substrat; limfoblaste – celule sferice, care
cresc în suspensie fără a se atașa de un substrat.
Linii
celulare utilizate frecvent
Celulele
HeLa (fig. 1) sunt celule canceroase cervicale umane, cultivate
pentru prima dată în laborator în 1951 și reprezintă prima linie celulară
continuă (1). În prezent, există mai multe tulpini de celule HeLa. Primele
celule au provenit dintr-o probă recoltată de la o femeie pe nume Henrietta
Lacks și au fost numite preluând primele două litere ale numele și prenumelui.
Medicul George Gey este cel care a generat această linie celulară și cel care
avea să o distribuie și celorlalți cercetători din întreaga lume pentru a o
folosi la diverse experimente. Pe celulele HeLa s-a dezvoltat vaccinul
poliomielitic, s-au testat diferite tipuri de toxine și radiații, s-au
investigat infecția HIV/SIDA, procesul de oncogeneză sau medicamente
antitumorale. Pe lângă rolul important în evoluția culturilor celulare, aceste
celule au ridicat și numeroase controverse etice privind confidențialitatea
datelor pacienților de la care se recoltează organe și țesuturi.
Linia
celulară HEK293 (fig. 2) este o linie celulară continuă derivată
din celule embrionare renale umane transformate prin intermediul adenovirusului
tip 5 (2). Genele virale ce se exprimă în această linie celulară determină
producerea unui număr mare de proteine recombinante. Aceasta este folosită
frecvent pentru transfecții, în special atunci când se folosesc ca vectori
adeno- sau retrovirusuri. Este necunoscut ce tip de celule sunt HEK293 și este
dificil a se concluziona după transformare, pentru că includerea unei segment
viral de 4,5 kilobaze a modificat semnificativ morfologia celulară și expresia
genetică, la aceste impedimente adăugându-se diversitatea celulară a
rinichiului embriologic, care cuprinde aproape toate tipurile celulare. Se
presupune că acestea ar fi de origine neuronală pe baza mARN și a proteinelor
specifice neuronilor, dar sunt și dovezi ale provenienței din glandele adrenale
sau fibroblaste (3).
Celulele
stem mezenchimale (MSC) derivă din mezoderm și dau naștere diferitelor tipuri
de țesuturi, printre care os, cartilaj și țesut adipos (4). Spre deosebire de
mezenchim, care produce atât țesut conjunctiv, cât și țesut hematopoietic, MSC
nu dau naștere la celule hematopoietice. O caracteristică importantă a acestor
celule este aceea că, într-un mediu optim de cultură, se pot divide,
păstrându-și proprietățile de celulă stem pluripotentă, iar atunci când sunt
cultivate în medii diferite de diferențiere dau naștere la miocite, adipocite,
condrocite sau osteocite.
Selectarea
liniei adecvate
Selectare
liniei celulare adecvate pentru un experiment trebuie să aibă în vedere mai
multe criterii.
Specia:
liniile celulare non-umane impun mai puține restricții de biosiguranță, dar nu
pot fi întotdeauna folosite în anumite experimente ce studiază expresia unor
molecule specifice numai speciei umane.
Contaminarea:
una dintre cele mai frecvente probleme întâlnite în laboratoarele de culturi
celulare este contaminarea culturilor. O infecție poate altera semnificativ
biologia celulelor și compromite rezultatul experimentelor. Dacă o infecție
bacteriană sau fungică este mai ușor de detectat, cele date de virusuri sau de Mycoplasmaspp. sunt mai dificil de identificat.
Autenticitatea
liniei celulare: este important ca, la începutul
experimentelor cu o nouă linie celulară, să se verifice dacă linia este sau nu
contaminată cu alte linii. Pentru a identifica precis tipul celular, se poate
folosi tehnica STR (short tandem repeats) sau cariotiparea. Riscul de a
întâlni o linie celulară „impură” este mare, având în vedere că există peste
patru sute de linii celulare incorect identificate înregistrate în baza de date
ICLAC (International Cell Line Authentication Committee) (5).
Pasajul:
liniile celulare canceroase, din pricina instabilității genetice, prin pasaje
succesive, își vor modifica expresia la nivel molecular, ceea ce duce la o
îndepărtare de celulele inițiale (6). Pentru a evita acest inconvenient, se
recomandă a se păstra stocuri provenind dintr-un pasaj mic și decongelarea
ulterioară, cu reluarea culturii. Uneori, modificarea culturilor este vizibilă,
cum este cazul celulelor U87, care, după cultivări succesive, își pierd
proprietatea de a crește în monostrat și se identifică drept sferoizi pe flask.
Celule
normale sau transformate: liniile celulare transformate au o rată
de multiplicare mai mare și se divid infinit, solicită mai puțin ser în mediu,
dar fenotipul lor a fost modificat prin mutații genetice care pot influența
rezultatul experimentului.
Parametrii
de creștere: care sunt condițiile pentru optimizarea creșterii,
densității sau clonării? De exemplu, pentru a se obține la rate înalte o
proteină recombinată, se preferă o linie celulară cu un timp de dedublare scurt
și o rată de creștere mare.
Cultură
finită sau continuă: dacă în culturi finite liniile celulare
exprimă funcțiile corecte, apropiate de cele ale țesutului inițial, culturile
continue sunt mai ușor de menținut in vitro sau de clonat.
Alte
aspecte: dacă se folosește o cultură finită, sunt stocurile
suficiente pentru a realiza toate experimentele? Este linia celulară bine
caracterizată în literatură sau necesită o validare proprie? În cazul în care
se folosesc culturi transformate, trebuie să se realizeze aceleași experimente
și pentru linia normală care este folosită în acest caz ca și control. Dacă
linia celulară nu este stabilă, ea trebuie crioprezervată.