Thomas Hartung este profesor de toxicologie, farmacologie, microbiologie
moleculară și imunologie la Bloomberg School of Public Health din cadrul Universității
Johns Hopkins din Baltimore și la Universitatea din Konstanz, precum și directorul
Centrului pentru alternative la testele pe animale (CAAT) dezvoltat de cele două
universități. În cadrul CAAT funcționează consorțiul pentru toxicologia bazată pe
dovezi, colaborarea pentru bune practici privind culturile de celule, colaborarea
pentru toxicologie ecologică, precum și un grup de lucru pentru rafinare industrială.
Conduce proiectul toxomului uman, finanțat de National Institutes of Health. Înainte
de Johns Hopkins, a condus centrul Comisiei Europene pentru validarea metodelor
alternative la testele pe animale (ECVAM).
A publicat peste 450 de articole științifice
și are peste 21.200 de citări; are un indice h de 73 și peste 300 de articole citate
de cel puțin zece ori fiecare.
Thomas Hartung a fost prezent recent la Manchester,
la EuroScience Open Forum 2016, unde a organizat o serie de sesiuni despre toxicologie
și despre studiile preclinice. Cu acest prilej, a acordat un interviu în exclusivitate
pentru „Viața medicală“.
– Marea întrebare din cercetarea clinică este:
de ce sunt atât de multe studii clinice care nu dau rezultate?
– După cea mai recentă evaluare, 95% din medicamentele
care ajung în studiile clinice nu confirmă. E destul de clar că investim bani în
substanțele greșite. Și chiar și din medicamentele care reușesc să confirme în studiile
clinice, 10% sunt retrase ulterior din cauza efectelor secundare sau a ineficienței,
insuficient evaluate anterior. Un articol pe care l-am publicat în 2013 se intitula:
„Privind înapoi cu mânie – ce ne spun studiile clinice despre cercetarea preclinică“.
Și sunt mai multe motive pentru care modelele animale nu ne reprezintă corect. Să
luăm ca exemplu testele de siguranță, bine standardizate și pentru care există proceduri
de asigurare a calității. Aceste teste pe animale sunt reproductibile doar în proporție
de 70–90%, speciile utilizate nu pot prezice rezultatele obținute la alte specii
mai mult de 60% și nu există niciun motiv pentru care ar prezice mai bine rezultatele
la om decât pe cele dintre specii diferite. Dar aceleași probleme de reproductibilitate
sunt valabile și pentru celelalte metode preclinice. Culturile celulare sunt incredibil
de predispuse la apariția de artefacte. Foarte multe cercetări sunt efectuate cu
linii celulare care nu sunt ceea ce ar trebui să fie.
Problema culturilor celulare
– Chiar există un scandal privind retragerea
unor articole care prezentau rezultate obținute pe alte linii celulare decât cele
studiate în realitate.
– Exact. Anul trecut, de pildă, s-a făcut evaluarea
a patru sute de linii celulare din China și s-a dovedit că 25% din ele erau altceva
decât se credea. Să nu arătăm cu degetul spre China, ei doar au avut ideea de a
evalua problema. Acum 15 ani, o evaluare făcută de o bancă de celule din Germania
a găsit că 28% din celule nu erau ce ar fi trebuit să fie, în unele cazuri până
și specia era greșită.
– Cum se poate întâmpla asta? Cum ajungi să
ai o linie celulară greșit catalogată?
– În cercetare, se lucrează cu mai multe linii
celulare în același timp. Și, dacă nu ești suficient de atent, o singură celulă
poate fi transferată dintr-o cultură în alta, folosind aceeași pipetă pentru mediu,
de pildă, iar acea celulă unică, având un ritm de creștere mult mai rapid, poate
să înlocuiască, în timp, celelalte celule.
– Și cercetătorii nu pot să-și dea seama că
se întâmplă o astfel de substituție?
– Doar dacă au suficientă experiență. Dar mai
sunt și alte probleme, de etichetare, de exemplu. Apoi, sunt și probleme mai greu
de anticipat. Noi, la Johns Hopkins, ne-am confruntat cu o situație care ne-a costat
un milion de dolari, bani din cercetare, și doi ani de muncă. Foloseam celule dintr-o
linie cu originea în cancerul de sân, MCF-7, pe baza căreia au fost publicate nu
mai puțin de 23.000 de articole științifice. Aveam un consorțiu de cercetare și
două laboratoare utilizau aceleași celule. Ele au comandat celule identice, din
același lot, de la aceeași bancă de celule. Dar am văzut rapid că rezultatele obținute
erau complet diferite. Până și culturile arătau diferit. Am făcut schimb de celule
și am văzut că nu era vina laboratoarelor, ci a liniei celulare. Ca să înțelegem
ce se întâmplă, am făcut hibridizarea genomică comparativă și am găsit diferențe
în opt locusuri din genom, părți mari din genom.
Franken-celule
– Care era explicația?
– În cazul nostru, am putut merge mai departe
cu analiza, pentru că ambele laboratoare comandaseră câte două fiole și astfel rămăsese
câte o fiolă nedesfăcută. Și acestea arătau aceleași diferențe. Asta înseamnă că
nici măcar celulele înghețate din același lot, la aceeași bancă, nu sunt identice.
Fiecare linie celulară devine, în timp, un amestec de diverse subpopulații celulare.
– Și cum se poate preveni o astfel de situație?
– În primul rând, ar trebui să folosim celulele
tumorale doar pentru ceea ce sunt – modele de tumori. Prea des, ele sunt utilizate
ca model de celule sănătoase. Sunt instabile genetic – toate celulele MCF-7 au o
lipsă de 10% din întregul genom, în 50% din cazuri erau mai puțin de două copii
ale unei gene, dar în 30% din cazuri erau creșteri de până la 30 de copii ale unor
gene. Sunt „Franken-celule“, nu celule normale. Primul pas deci este să renunțăm
la ele.
– Dar în aceeași situație sunt și celulele HeLa,
folosite deja de peste șase decade.
– Da, e exact aceeași situație. Doar că sunt
cam 70.000 de articole cu celulele HeLa, iar analiza genomică a arătat exact aceleași
probleme. Problema noastră este că nu dispunem de celule umane specializate. Din
2006 însă, dispunem și de celule stem pluripotente induse (iPS), deci putem reprograma
celule din piele sau din sânge să devină celule embrionare, capabile să producă
alte țesuturi.
– Sunt mai bune?
– Da, sunt mult mai stabile genetic, precum
celulele primare. Nu sunt perfecte și probabil că își vor arăta limitele în viitor,
dar măcar nu sunt celule tumorale, în care informația genetică a scăpat de sub control.
Good Cell Culture Practice
– Apropo de liniile celulare tumorale, unele
au fost utilizate la producerea de vaccinuri. Poate fi astfel afectat produsul final?
– Nu m-aș aștepta la asta. Dar trebuie spus
că nu mai ai controlul, sistemul nu e neapărat identic. Trebuie să fim mult mai
atenți atunci când controlăm identitatea celulelor cu care lucrăm și nu doar să
nu le amestecăm între ele, ci și pentru că se pot schimba cu timpul. Tehnologiile
standard nu arată aceste diferențe. În esență, cred că ar trebui să trecem la utilizarea
celulelor derivate din celule stem.
– Această mutare va crește costul cercetării?
– Da. Dar, dacă iei în calcul cât pierzi pentru
că sistemele tale nu sunt reproductibile, cât „zgomot“ publici, atunci perspectiva
se schimbă. Iar noi am învățat asta în modul cel mai dureros cu putință. Consorțiul
nostru a pierdut peste un milion de dolari fonduri de cercetare și doi ani. Și am
fost norocoși să ne dăm seama ce era greșit, pentru că aveam două laboratoare care
făceau, în principiu, același lucru. În mod normal, un experiment e făcut de un
singur laborator și nu ai cum să identifici o astfel de problemă.
– Dar asta înseamnă că trebuie să reevaluăm
ceea ce s-a publicat până acum și ceea ce credem că știm?
– Cred că da, trebuie să fim foarte atenți cu
ceea ce s-a publicat, pentru că, de cele mai multe ori, nu avem suficiente informații.
Nu e îndeajuns să știi că ai lucrat cu celule MCF-7, trebuie să știi cât de aproape
a fost și față de ce clonă și cum a fost controlată cultura. E clar însă că adesea
ținem celulele prea mult și se produc mutații. Regulile de bună practică privind
culturile celulare (Good Cell Culture Practice – GCCP) formulează o serie de recomandări
privind controlul identității celulelor, al infecției cu Mycoplasma – și asta e
o altă problemă, trebuie să presupunem că între 15 și 30% din culturile celulare
utilizate în prezent sunt infectate cu micoplasme. Infecția schimbă somatic comportamentul
celular. Și sunt prea puține laboratoarele care fac screening sistematic pentru
această infecție.
– Dar acum este inclus în GCCP?
– GCCP îl cere, dar cine îl aplică? Revistele
științifice nu cer acest screening. Dacă însă ar fi parte dintr-un checklist, dacă
vreau să public un studiu pe o linie celulară, ar trebui să confirm că am testat
pentru micoplasme.
Organe pe cip
– Nici revistele de prestigiu nu solicită aceste
precizări?
– Ba chiar dimpotrivă, au descrieri foarte scurte
ale metodologiei și această informație este omisă. Comparativ, studiile pe animale
sunt mai avansate, pentru că acolo există, de cinci-șase ani, ghiduri despre cum
trebuie raportate rezultatele. Din acest motiv, am profitat de organizarea EuroScience
Open Forum, la sfârșitul lunii iulie, la Manchester, și am anunțat crearea unei
colaborări internaționale în domeniul GCCP, un efort transatlantic și transpacific,
de stabilire a standardelor și de extindere a lor la modele derivate din celule
stem și la modele de organe „pe cip“. Ne-am propus să finalizăm, în 2017, o versiune
nouă a GCCP, iar în paralel dezvoltăm și strategia de implementare. Sperăm ca instituțiile
care finanțează cercetarea, precum NIH, să accepte noile ghiduri ca pe o precondiție
a finanțării. Este o parte a inițiativei de a face știința mai reproductibilă. De
asemenea, dezvoltăm standarde pentru raportarea rezultatelor obținutein
vitro. Autorii vor trebui să furnizeze informații asupra sistemelor utilizate, astfel
încât rezultatele să poată fi reproduse.
– Sunteți motorul din spatele acestei inițiative,
dar aveți și sprijinul centrelor universitare importante din SUA și din Europa?
– Inițiativa nu este una academică, ci mai degrabă
a agențiilor și organizațiilor de reglementare.
În acest minicreier, neuronii (roșu) formează o rețea și comunică între ei. Nucleii sunt colorați în albastru Foto: Johns Hopkins Center for Alternatives to Animal Testing
– Cu alte cuvinte, vreți ca regulile să devină
obligatorii pentru oricine aplică pentru fonduri publice?
– Acesta ar fi obiectivul. Visăm la impunerea
unor standarde care să condiționeze finanțarea și publicarea în revistele de top.
Trebuie să promiți și apoi să demonstrezi că munca ta e una de calitate.
Minicreierele de la Johns Hopkins
– Recapitulând, în cercetarea preclinică avem
probleme cu studiile pe culturi de celule, dar și în studiile pe animale. Ce alternative
există?
– Încercăm să dezvoltăm sisteme fiziologice
umane, care să reflecte nu atât celulele, cât organele și sistemele. Aceasta este
marea tendință inovatoare a momentului. Cultura clasică de celule arată ca un ou
ochi într-o tigaie. Celulele nu prea au contact unele cu celelalte, de obicei e
un singur tip celular și nu reproducem nimic fiziologic, nici arhitectura tisulară
și nici funcția. În ultimii ani, prin combinarea culturilor de celule cu bioingineria,
au fost create numeroase „miniorgane“. Acestea pot să reproducă unele funcții ale
organului. Noi am reușit să dezvoltăm un model de „minicreier“, plecând de la fibroblaști
recoltați din pielea donatorilor, reprogramați în celule stem pluripotente. Minicreierul
rezultat are toate tipurile celulare întâlnite în creier cu excepția microgliilor.
Neuronii formează spontan circuite electrice și comunică între ei prin neurotransmițători
și prin depolarizarea celulară, deci putem vorbi despre funcționalitatea miniorganului.
Cu aceste modele, putem dezvolta studii ale diferitelor boli cu afectare cerebrală,
în principiu cu rezultate superioare experimentelor pe animale. Nu este un model
complet identic, dar este un echivalent uman.
– Dar vă lipsesc și alte lucruri, precum microbiota,
implicată în numeroase procese fiziologice, un posibil factor determinant în anumite
condiții.
– E un punct important acesta, dar problema
exista deja în studiile pe animale. Microbiomul șobolanului nu este similar cu cel
uman. Și între doi oameni abia dacă avem o suprapunere de 50%. Dar există micromodele
de intestin, care uneori includ microbiota.
Nu suntem șobolani de 70 de kilograme
– Microbiota nu este implicată doar în imunitate,
ci și în expresia unor neurotransmițători.
– Ideea corectă este că „toate modelele sunt
greșite, dar unele dintre ele sunt folositoare“, un citat celebru din George Box.
Nu suntem șobolani de 70 de kilograme și prea des luăm experimentele pe animale
ca răspunsuri valabile la om. La fel, nu ar trebui să credem că un experiment pe
o cultură celulară, oricât de sofisticată, ne poate oferi toate răspunsurile. Trebuie
să înțelegem limitele unui model, reproductibilitatea experimentelor și relevanța
lor pentru întrebările la care căutăm răspuns. Cred însă că o combinație inteligentă
a acestor modele ne poate ajuta să abordăm fiziologia umană, bolile și tratamentul
acestora.
– Credeți că, în timp, aceste modele inteligente
vor reduce costurile cercetării biomedicale, care acum se reflectă pe rafturile
farmaciilor?
– Sunt foarte sigur de asta. O analiză publicată
anul trecut arăta că doar în SUA se cheltuiesc 28 de miliarde de dolari anual pentru
cercetări biomedicale nereproductibile. Sunt prea mulți bani risipiți pe lucruri
de care ne putem lipsi. Construind modele mai relevante și mai robuste, cum sunt
miniorganele, avantajele sunt foarte mari. În ultimii 20 de ani, am văzut cum modelele
de piele umană produse pe scară largă au dus la o înaltă standardizare a culturilor
și au permis utilizarea de produse umane, mai sigure decât cele de origine animală.
– Credeți că industria va adopta aceste metode
noi?
– Am văzut un interes crescut și poate nu atât
din partea organismelor de reglementare, unde încă mai avem de dus multă muncă de
convingere, cât dinspre cercetările de descoperire de noi medicamente. Noile metode
promit rezultate mai relevante și interesul e pe măsură.
Zece miniorgane pe aceeași platformă
– Dar cât de relevant poate fi modelul unui
minicreier într-un vas Petri pentru cercetarea în domeniul creierului?
– Cred că relevanța va fi și mai mare atunci
când vom pune minicreierul pe un cip și îl vom perfuza, pentru că vom putea reproduce
homeostazia și eventuale modificări în dinamică. Odată ce vom reuși să perfecționăm
aceste miniorgane, vom trece la combinarea lor, pentru a studia interacțiunile dintre
ele. Un program american, realizat la Harvard și MIT, vizează producerea unei platforme
pentru zece miniorgane, care să „conviețuiască“ timp de o lună. Minicreierul dezvoltat
de noi a fost realizat cu fonduri de la NIH și va fi utilizat în aceste platforme.
– Cum credeți că va funcționa?
– Nu e chiar atât de SF pe cât ați putea crede.
O companie din Berlin realizează deja combinații de până la patru organe și are
comenzi de la Howard Hughes Institute. Vedem tot mai mult că asemenea coabitări
de organe favorizează interacțiuni altfel imposibil de cercetat. Echivalentul ficatului
metabolizează medicamentul, care apoi acționează asupra celorlalte miniorgane...
Creier la gheață
– Dar unele modele sunt mai ușor de realizat
decât altele. Creierul e probabil cel mai greu de realizat.
– Acesta e și motivul pentru care cred că nu
orice laborator ar trebui să producă aceste modele de miniorgane. Dacă aș vrea să
vă pregătesc să produceți minicreiere în laboratorul dv., probabil că perioada de
instruire ar fi de cel puțin un an. Trei luni durează numai cultura propriu-zisă.
Și sunt ajustări și optimizări de realizat pe parcurs. Noi am reușit să punem la
punct o tehnologie de înghețare a acestor minicreiere, ceea ce înseamnă că le putem
trimite și către alte laboratoare, unde să fie utilizate după nevoie. Iar această
tehnică de prezervare e importantă și pentru realizarea platformei multiorgan. Nu
vor fi multe centre capabile să producă zece organe și să le aibă pe toate la dispoziție
la momentul potrivit. Și dacă rinichiul brusc nu merge, ce se întâmplă? Tot experimentul
eșuează.
– Această tehnică de înghețare ar putea fi utilizată
și pentru transportul organelor prelevate pentru transplant?
– Mă îndoiesc. Tehnica noastră se bazează pe
mărimea acestor miniorgane, cu dimensiunea de trei-cinci micrometri. Tocmai mărimea
lor ne permite să le congelăm într-o manieră sincronizată, fără formarea de cristale
de gheață. Ar fi foarte dificil să controlăm congelarea unui organ în mărime naturală.
Revenind la modelul nostru de minicreier, el este utilizat pentru cercetarea privind
virusul Zika.
– Cum ajută acest model studiile cu Zika?
– Am realizat deja studii de infecție a modelului
nostru cu virusul Zika și cu virusul JC și am observat că aceste virusuri cresc
pe minicreiere. Sperăm ca astfel să poată fi cercetate strategii antivirale. În
Brazilia, de pildă, se folosește modelul creat de noi pentru a studia succesul vaccinării
împotriva virusului Zika. Mai exact, folosind serul animalelor și apoi al oamenilor
vaccinați, putem prezice capacitatea de protecție împotriva infecției folosind minicreiere.
Ar fi, practic, un instrument care să ne permită identificarea rapidă a celui mai
bun vaccin.
Modele in silico
– Pe lângă aceste miniorgane, nu ar putea fi
utilizate și modele in silico mai complexe ale organelor, date fiind progresele
tehnologiei de procesare a informației?
– Într-adevăr, aceasta este o altă tehnologie
inovatoare, chiar dacă modelele propriu-zise nu sunt încă foarte avansate. În Germania,
există un mare proiect pentru un model in silico de ficat, iar agenția americană
de protecție a mediului lucrează la un model embrionar virtual. Nu e deloc simplu.
Însă dispunem tot mai mult de mari seturi de date. În februarie, de exemplu, am
anunțat că am reușit să creăm cea mai mare bază de date cu studii de toxicologie.
Am putut accesa baza de date a agenției europene de chimie (ECHA) și am făcut-o
„citibilă“ pentru computer. Erau zece mii de substanțe chimice în baza de date și
opt sute de mii de studii toxicologice. Problema era că datele erau disponibile
ca text. Noi nu doar că am transformat-o într-o bază de date, ci am folosit procesarea
limbajului natural cu inteligență artificială. Astfel, am putut arăta că algoritmi
foarte simpli, bazați pe similaritatea structurii chimice, ating un nivel de predictibilitate
similar testelor pe animale.
– Și aici trebuie spus că datele existente sunt
obținute în teste realizate pe animale sau persoane sănătoase, iar anumite condiții
precum simpla temperatură a mediului pot influența dramatic toxicitatea unor compuși
și modul în care aceștia penetrează de pildă bariera hematoencefalică.
– Sunt multe date care încă necesită clarificare.
Nu vom trăi niciodată într-o lume care să aibă toate răspunsurile. Dar putem începe
prin rezolvarea problemelor mari și putem dezvolta strategii pentru rezolvarea celorlalte.
Modelele computaționale au și ele problemele lor, nu pot fi mai bune decât datele
pe care le introducem. Putem lua internetul ca exemplu. Sunt miliarde de pagini,
din care multe nu sunt bune, dar multe altele sunt. Prin abordarea bazată pe inteligența
artificială, cum este motorul utilizat de Google, obținem rezultate foarte bune
între primele pagini, atunci când căutăm ceva. Dintr-o mulțime de date, putem astfel
extrage informație cu sens.
– Dar aveți nevoie de algoritmi foarte buni.
– Utilizăm exact aceiași algoritmi, pentru a
extrage informația care ne interesează, chiar dacă seturile de date nu sunt complete.
Proiectul toxomului uman
– Datele acestea vor fi utilizate și în Proiectul
toxomului uman?
– Proiectul toxomului uman este un consorțiu
care încearcă să folosească tehnologiile omice, o altă cale de a genera seturi foarte
mari de date. Prin tehnologia de astăzi, poți măsura expresia genică din fiecare
țesut. Rezultatele sunt însă foarte puternic bruiate: măsori 27.000 de gene și numărul
de măsurători pe care le poți face e prea mic pentru a da un răspuns. Combinând
însă transcriptomica și metabolomica, putem studia suprapunerile și astfel identifica
perturbările la nivel de genă; dacă în același pas se schimbă și metaboliții, e
clar că acolo se întâmplă ceva. Această combinație de tehnici omice poate identifica
mecanisme și utilizăm aceiași algoritmi de procesare pentru a găsi sensul acestor
volume uriașe de date. De altfel, așa am și reușit să găsim problemele din modelul
MCF-7 – și am realizat ce greșeală am făcut utilizând acea linie celulară. Dar,
trăgând linie, de fapt vorbim de câteva tehnologii inovatoare – big data, tehnologiile
omice, tehnologiile de culturi celulare care au devenit aproape culturi de organe,
acestea sunt tehnologiile secolului 21.
– Și le vedeți având și un impact clinic?
– Da, producem date mai relevante, care vor
îmbunătăți procesul de descoperire de noi medicamente. Dar asta rămâne să dovedim.
Dacă începem astăzi să dezvoltăm noi medicamente, ele vor ajunge pe piață abia peste
doisprezece ani. Abia atunci vom putea spune că toate aceste tehnologii vor fi avut
impact clinic. Să luăm exemplul minicreierelor: 20% din studiile clinice vizează
bolile creierului. Există deja analiza care arată că problema principală de până
acum erau modelele animale. Un model bun ne va ajuta să progresăm mai repede în
boli precum Alzheimer, Parkinson sau chiar în accidentele vasculare cerebrale. Medicina
secolului 21 are nevoie de instrumentele secolului 21. Mai ales în culturile de
celule, înregistrăm multe promisiuni neonorate. Și avem acum șansa să dezvoltăm
un instrument foarte util, care să compenseze nu doar neajunsurile culturilor celulare,
ci și pe cele ale studiilor pe animale, ajutându-ne să trecem mai repede la testele
pe oameni. Dar este nevoie ca întreaga comunitate internațională, cercetători, organisme
de reglementare și finanțatori să adopte aceste tehnologii noi.
Dacă vrei să fii la curent cu tot ce se întâmplă în lumea medicală, abonează-te la „Viața Medicală”, publicația profesională, socială și culturală a profesioniștilor în Sănătate din România!
Cookie-urile ne ajută să vă îmbunătățim experiența pe site-ul nostru. Prin continuarea navigării pe site-ul www.viata-medicala.ro, veți accepta implicit folosirea de cookie-uri pe parcursul vizitei dumneavoastră.
