Modelul experimental canin folosit de Paulescu a fost următorul: după anestezie, câinelui i se extirpă pancreasul; ţesutul pancreatic era tocat, amestecat cu apă distilată şi pus la gheaţă; lichidul era strecurat prin muselină şi se adăuga o cantitate mică de sare.
„On extirpe complètement le pancréas. Puis, en prenant des précautions minutieuses d’asepsie, on hache cette glande dans un broyer Latapie, stérilisé au four. Ensuite on ajoute, a ce hachis, dix fois son poids d’eau distillée stérilisée et, après l’avoir agité a plusieurs reprises, on le place à la glacière. Au bout de 24 heures, on filtre ce hachis à travers une double compresse de tarlatane stérilisée, et on ajoute, au filtratum, 7 pour 1000 de NaCl“.
Publicaţia lui Paulescu din 1921 descrie un model experimental bine gândit, elegant şi foarte convingător, bazat pe injectarea intravenoasă a unei emulsii pancreatice integrale. Metoda este prezentată drept originală, în măsura în care Paulescu nu menţionează numele niciunui alt cercetător.
„(...) întrebarea firească a fost dacă o emulsie de pancreas nu ar putea să ajute organismul diabetic la eliminarea excesului de zahăr. În investigarea acestei probleme am fost ghidaţi de două principii. Mai întâi, dat fiind că proprietăţile chimice ale substanţei sau substanţelor cu această acţiune din pancreas erau necunoscute, ni s-a părut necesar să evităm proceduri complicate de purificare; aşadar, am adoptat o extracţie simplă în apă cu diluare ulterioară cu apă sărată. În al doilea rând, dat fiind că extirparea pancreasului îşi produce efectul în timp foarte scurt, am realizat că în mod normal pancreasul varsă această substanţă în sânge în mod continuu în cantităţi foarte mici. Am hotărât aşadar să injectăm preparatul pancreatic pe cale intravenoasă foarte încet şi ne-am aşteptat să aibă efect numai câteva ore după injecţie. Urmând aceste principii am obţinut rezultate foarte mulţumitoare; într-un cuvânt, infuzia intravenoasă lentă a unei emulsii în apă a pancreasului a dus de obicei la o scădere marcată, de scurtă durată, a glucozei din sânge şi urină.“
Acest fragment dintr-o publicaţie ştiinţifică ar putea constitui un rezumat al metodei experimentale şi rezultatelor experienţei ale lui Nicolae Paulescu. El face parte însă dintr-o lucrare publicată în Journal of Biological Chemistry în 1919 de Israel Kleiner, de la Rockefeller Institute for Medical Research, New York (Israel S. Kleiner. The action of intravenous injections of pancreas emulsions in experimental diabetes. Journal of Biological Chemistry, 1919, p. 154–155). Israel Kleiner prezentase, la şedinţa National Academy of Sciences din 19 aprilie 1915, date privind efectul injectării intravenoase a extractului apos de pancreas asupra hiperglicemiei la câinele depancreatizat şi publicase aceste date în acelaşi an (Israel S. Kleiner, Samuel J. Meltzer. Retention in the circulation of dextrose in normal and depancreatized animals, and the effect of an intravenous injection of an emulsion of pancreas upon this retention. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1915, p. 388–341).
Metoda experimentală descrisă de Kleiner implică următoarele etape: după anestezie generală, se proceda la extirparea totală a pancreasului. Pancreasul era apoi tocat şi amestecat cu o cantitate de apă distilată sterilă, după care amestecul era pus la gheaţă. După un interval de timp de până la 20 de ore, preparatul era strecurat prin muselină, iar lichidul obţinut în acest fel era diluat în proporţie de 1:5 cu o soluţie de ser fiziologic (9 g de sare la un litru de apă).
„Preparation of Emulsion: Fresh dog’s pancreas was hashed, mixed with three or four times its weight in distilled water and placed in the refrigerator. After a period of from 1 to 20 hours it was strained and squeezed through muslin. The fluid thus obtained was diluted with 5 volumes of sterile 0.9 per cent NaCl solution before injection.“
Rezultatele comunicate de Israel Kleiner sunt foarte convingătoare: cantitatea de glucoză din sânge a scăzut de la 2,8 g/litru la 0,9 g/litru la sfârşitul infuziei şi la 0,8 g/litru 90 de minute mai târziu, în timp ce cantitatea de glucoză din urină a scăzut de la 9,2 g/litru la 0 în acelaşi interval de timp.
Israel S. Kleiner (1885–1966) s-a născut în New Haven, Connecticut şi a obţinut doctoratul în biochimie la Yale University în 1909. Din 1910 a lucrat cu Samuel J. Meltzer în departamentul de fiziologie şi farmacologie de la Rockefeller Institute for Medical Research din New York. În 1919 a fost numit profesor la New York Medical College, unde a rămas până la sfârşitul vieţii ca şef al catedrei de biochimie şi decan. Pentru contribuţia lui la descoperirea insulinei, New York Academy of Sciences i-a acordat prestigiosul Van Slyke Award in Clinical Chemistry (1959).
Articolele lui Kleiner şi Paulescu au fost citate, în aceeaşi frază, de Frederick G. Banting şi colaboratorii lui în descrierea primului succes clinic al insulinei: „(...) Kleiner (5) and Paulesco (6) have tried the effects of aqueous extracts of pancreas intravenously on depancreatized animals and have found transitory reductions in the percentage of blood sugar and in the sugar excreted in the urine“ (Banting FG, Best CH, Collip JB, Campbell WB, Fletcher AA. Pancreatic extracts in the treatment of diabetes mellitus. Canadian Medical Association Journal, 1922, vol. 12, p. 141–146). Articolele citate erau, pentru Israel Kleiner, cel din Journal of Biological Chemistry, 1919, iar pentru Nicolae Paulescu cel din Comptes Rendus de la Société de Biologie et de ses Filiales, 1921.
La 10 aprilie 1922, Paulescu a obţinut, în România, brevetul de invenţie al „pancreinei“ şi al modului ei de preparare. Materia primă era o tocătură de pancreas prelevat de la un animal proaspăt sacrificat. Tocătura era cântărită şi i se adăuga apă distilată într-un volum de 10 ori greutatea tocăturii. Preparatul era pus la gheaţă. După 6 până la 24 de ore, amestecul trebuia filtrat printr-o compresă dublă de muselină. Filtratului i se adăuga acid pentru precipitarea proteinelor. Preparatul era apoi filtrat din nou şi neutralizat cu sodă caustică. După cum se vede, metoda brevetată de Paulescu începea cu procedeul de extracţie apoasă la rece, publicat pentru prima oară de Israel Kleiner în 1919, şi continua cu înlăturarea unor substanţe prin precipitare cu acid clorhidric şi sodă caustică. Secvenţa acidifiere/alcalinizare a unui extras apos de pancreas fusese descrisă în Statele Unite în 1913 (Murlin JR, Kramer B. The influence of pancreatic and duodenal extracts on the glycosuria and the respiratory metabolism of depancreatized dogs. Journal of Biological Chemistry, 1913, p. 367). Produsul injectat bolnavilor de la Toronto General Hospital începând din ianuarie 1922 fusese obţinut de James. B. Collip prin extracţii succesive cu alcool, eter şi alcool, etape care nu se întâlnesc în brevetul lui Paulescu.
Metoda folosită de Nicolae Paulescu în experienţele publicate în 1920 şi 1921 este identică cu metoda lui Israel Kleiner. Justificarea metodei este facută numai de Israel Kleiner. Privite cronologic, lucrările publicate de Kleiner (1915, 1919) şi Paulescu (1920, 1921) indică faptul că prioritatea pentru folosirea acestei metode îi revine cercetătorului american.
În 1924, Nicolae Paulescu a povestit astfel istoria cercetărilor sale: „În 1916 am injectat un extract apos de pancreas în sângele unui câine diabetic prin extirparea pancreasului; rezultatul a fost conform aşteptărilor: simptomele diabetului au fost imediat şi temporar suprimate. Dar războiul ne-a întrerupt experienţele. Când le-am putut relua, în 1920, am studiat metodic…“ (N. Paulescu. Recherches expérimentales sur l’action des extraits pancréatiques dans les phénomènes dudiabète chez les animaux. Société Médicale des Hôpitaux, séance du 14 mars 1924, p. 330). Paulescu nu a publicat însă niciodată metoda sau rezultatele experienţelor sale din 1916.
Documentele dovedesc că, în 1920–1921, Nicolae Paulescu a făcut experienţe care au dus la descoperirea insulinei. Folosind o metodă identică, conceptual şi practic, cu cea descrisă în detaliu de Israel Kleiner în 1919, Paulescu a confirmat rezultatele obţinute de acesta cu privire la cea mai importantă proprietate a insulinei, anume scăderea cantităţii de glucoză din sângele şi urina unui animal cu diabet indus prin extirparea pancreasului. Amplificând investigaţiile lui Israel Kleiner, Paulescu a descris, pentru prima oară, efectul unui extract apos de pancreas asupra concentraţiei de corpi cetonici şi uree în sângele şi urina animalelor de laborator. Ansamblul experienţelor lui Paulescu constituie prima prezentare completă a proprietăţilor fundamentale ale insulinei în metabolismul glucidelor, grăsimilor şi proteinelor. Recunoaşterea priorităţii lui Israel Kleiner la inventarea metodei folosite în lucrările lui Paulescu nu ar fi diminuat în niciun fel valoarea cercetărilor savantului român, căruia îi datorăm descoperirea insulinei.
