Odată
cu reducerea costurilor și apariția noilor metode, există posibilitatea de
secvențiere a întregului exom sau genom, lăsând pe loc secund testarea țintită
a unor gene considerate de clinician a se corela cu patologia și fenotipul
bolii pacientului. Dacă, înainte de a dispune de noile tehnici de secvențiere
(NGS), dimensiunea fragmentelor de ADN ce puteau fi secvențiate era limitată,
în prezent, principala provocare este stabilirea contribuției pe care o are
gena investigată asupra unui fenotip dat. Cu toate acestea, în clinică,
principala utilitate a NGS este testarea genetică țintită și nu a întregului
genom (WGS). Testele de secvențiere multigenice sau țintite au trei mari indicații:
identificarea agenților patogeni în unele boli infecțioase; diagnosticarea
maladiilor cu transmitere genetică; stabilirea conduitei terapeutice în anumite
cancere somatice, indicație mai recent introdusă.
Genele
implicate în producerea unui fenotip poartă denumirea de locusul trăsăturilor
cantitative (quantitative trait locus – QLT) (1). Determinarea QLT se
face prin identificarea markerilor moleculari – cum sunt SNP (single
nucleotide polymorphism) și AFLP (amplified fragment length
polymorphism) – care se corelează cu o trăsătură observată. La polul opus
se află cardiomiopatiile care au diferite prezentări clinice – dilatativă
(CMD), hipertrofică (CMH) sau displazia aritmogenă de ventricul drept (2). Deși
clinicianul poate să diferențieze între aceste entități, sunt și cazuri dificil
de încadrat, care necesită testare genetică; 5–10% din cazurile diagnosticate
cu CMH s-au dovedit a fi boli care mimează CMH (fenocopii), cea mai frecventă
fiind boala Fabry, determinată de deficitul de alfa-galactozidază, iar 2% din
pacienții cu CMH au variante patogene ale acestei gene (3). Importanța
descoperirii mutației Gla este esențială, întrucât este singura din
panelul genetic care permite un management țintit, prin terapia de substituție
enzimatică. Acest argument a dus la includerea testării genei GLA în testele
genetice destinate CMH.
Multă
vreme, testarea genetică a fost un mijloc marginal, de ultimă intenție
diagnostică, după ce toate celelalte mijloace au fost epuizate. Odată cu
acumularea de rezultate favorabile, locul geneticii în elucidarea etiologiei
unor boli a crescut ca importanță.
O
nouă provocare pentru clinician este și alegerea între testele țintite și
analiza întregului genom sau exom. Deși se folosește sintagma „secvențierea
întregului genom“, aceasta mai degrabă ar trebui denumită parțială, pentru că
nu este posibilă acoperirea în întregime, nici măcar a acelor regiuni genetice
incluse în teste țintite.
Atunci
când se utilizează WGS, doi parametri sunt esențiali: numărul de citiri
corespunzătoare pentru o anumită poziție (regăsit în literatura anglosaxonă ca sequencing
depth) și indicele de acoperire (sequencing coverage). Numărul de
citiri pentru o poziție reprezintă practic de câte ori a fost citită
aceeași secvență: de exemplu, se estimează că, pentru a detecta cu o bună
sensibilitate mutațiile la nivel de nucleotid, pentru genomul uman (care
conține trei miliarde de nucleotide) este necesară generarea a 90 de miliarde
de baze, prin urmare o multiplicare de treizeci de ori a fiecărei poziții.
Practic, pentru un nucleotid specific, numărul de citiri reprezintă numărul de
secvențe care au contribuit la acumularea de informații despre acel nucleotid.
Este important de menționat că numărul de citiri variază de-a lungul
diferitelor regiuni genomice, astfel încât anumite zone pot rămâne
nesecvențiate, iar altele să fie secvențiate de multe ori. Indicele de
acoperire este important pentru evidențierea rearanjamentelor, detectate prin
analiza perechilor citite. În NGS, fragmentele ADN sunt de 50–100 de baze
pentru fiecare capăt al secvenței de interes. Distanța estimată între perechile
citite este utilizată pentru a plasa secvențele la nivelul genomului, iar cele
neașteptate sunt utilizate pentru detecția anomaliilor structurale.
În
secvențierea exomului, acoperirea este între 90 și 95%, dar atunci când se
folosesc regiuni genetice, indicele de acoperire este și mai mic. De exemplu,
mai mult de 73 de gene sunt cunoscute a determina hipoacuzia non-sindromică
(4); datele arată că indicele de acoperire este de 92%, cu precizarea că patru
gene au o rată de secvențiere redusă, între 0 și 44% (5). În schimb, testarea
țintită își completează indicele de acoperire prin secvențiere Sanger și alte
tehnici, de exemplu, long-range PCR, o tehnică de amplificare a secvențelor
ADN de dimensiuni mari care în mod obișnuit nu pot fi amplificate utilizând
metode clasice. La aceasta se adaugă variația numărului de copii (copy
number variation) pentru a evidenția delețiile mari sau alte mutații
hetero- sau homozigote, care frecvent rămân nedetectate de secvențierea
exomului. Acest exemplu ilustrează și recomandarea Colegiului american pentru
genetică medicală și genomică, care indică secvențierea întregului exom numai
în cazul în care bateriile de teste țintite sunt negative.
Un
alt inconvenient al WGS este returnarea a sute de mii și milioane de variante
genetice, pentru că aceste analize se bazează pe variantele găsite în populația
de control, care sunt filtrate, câteodată cu prezumpția benignității lor. În
teste genetice țintite, interpretarea este realizată pentru fiecare variantă și
raportarea se face inclusiv pentru variantele cu semnificație necunoscută.
Astfel, la fiecare testare țintită se găsesc și variante genetice noi, care
îmbogățesc cunoștințele despre genomul uman și eventuala lor implicare în
patologie.
Un
alt potențial beneficiu al NGS l-ar putea reprezenta elucidarea mecanismelor
patogenice ale oncogenezei în vederea îmbunătățirii diagnosticului și
tratamentului cancerului. Grație NGS, este posibilă secvențierea genelor cu
expresie la nivel celular – transcriptomul sau exomul.
Un
exemplu elocvent în această direcție este tratamentul în cancerul pulmonar
asociat cu mutații ale EGFR (receptorul factorului de creștere epidermal) (6),
prezente în special la pacienții cu adenocarcinoame pulmonare, mai frecvent la
femei și nefumători. Medicamente țintite pe această mutație îmbunătățesc
prognosticul pacienților, fără efect însă pe alte tipuri de tumori pulmonare
sau chiar în cazul aceluiași timp de neoplazie dar fără mutația EFGR. Deși
inițial s-a crezut că translocațiile sunt specifice hemopatiilor, care se pot
detecta foarte ușor cu metode ieftine, citogenetice, NGS a modificat aceste
cunoștințe prin evidențierea de translocații în tumori solide: cancerul de prostată
și translocația între serin-proteaza 2 transmembranară și EFGR sau, în cancerul
pulmonar cu celule mici, translocația între proteina echinodermică asociată
microtubulilor tip 4 și ALK-tirozin-kinaza receptorului limfomului anaplazic.
Secvențierea
NGS a regiunilor țintite are numeroase avantaje comparativ cu secvențierea
întregului genom: creșterea indicelui de acoperire a regiunilor de interes,
scăderea costurilor și creșterea eficienței. Majoritatea metodelor ce folosesc
secvențierea țintită cuprind o etapă de selecție a regiunilor de interes prin
hibridizarea unor oligonucleotide specifice la genele vizate. Astfel, NGS a
permis analiza tuturor genelor codante din cancerul colorectal, pancreatic,
mamar și din glioblastom.
Pe
de altă parte, obținerea hărților cu secvențele nucleotidice ale țesuturilor
tumorale nu este suficientă, ci trebuie integrată cu expresia la nivel celular.
Legătura dintre secvența genetică și harta citogenetică necesită alte
experimente. Într-un proiect interesant (Cancer Genome Anatomy Project),
moleculele de ARNm au fost izolate din țesuturile tumorale și din cele normale
pentru ca apoi să fie convertite în ADNc sau biblioteci de analiză seriată a
expresiei genetice (SAGE) (7). Informațiile au fost depozitate în baze de date
publice. Folosind aceste date, CGAP a realizat cartarea prin FISH a clonelor
cromozomilor bacterieni artificiali utilizate pentru a genera secvențe genetice
umane. Un cromozom bacterian artificial (BAC) este o moleculă de ADN care se
poate transmite la bacterii și este util pentru a clona segmente de ADN de la
alte specii, de interes, în acest caz cele umane. Pe baza acestor cromozomi
artificiali bacterieni s-a realizat marcarea fluorescentă a benzilor
citogenetice. Astfel, este posibilă identificarea clonei bacteriene care se
colorează fluorescent la nivelul unei benzi citogenetice, citirea secvenței ADN
de la nivelul cromozomului bacterian și asocierea acesteia cu secvența
citogenetică. În această situație, BAC devine o punte de legătură care arată
cum o mutație genomică acționează la nivel citogenetic.
Cel
mai bun exemplu este descoperirea imatinibului mesilat. Condiția obligatorie
pentru a dezvolta noi tratamente care țintesc specific celulele tumorale este
înțelegerea țintei pe care aceste medicamente trebuie să o atingă. Aproximativ
95% din cazurile de leucemie cronică mieloidă prezintă translocația ce implică
regiunile BCR și ABL, de pe cromozomul 22, respectiv 9. Aceste mutații duc la
producerea unei tirozinkinaze activate constituțional, specifică celulei
tumorale. Imatinibul este un inhibitor selectiv al BCR-ABL-kinazei, care induce
remisiunea la peste 90% din pacienți. Pe lângă BCR-ABL, medicamentul este activ
și împotriva altor tirozinkinaze, pe c-kit și pe receptorul factorului de
creștere derivat din plachete, având potențial și în alte malignități, cum sunt
tumorile stromale gastrointestinale. Istoria arată succesul pe care îl au
medicamentele ce țintesc mecanisme moleculare specifice celulelor transformate
malign.
Aplicațiile
detaliate reprezintă numai o mică parte din potențialul pe care îl are NGS în
cercetarea fundamentală, dar și în practica clinică.