Secvențierea prin sinteză sau tehnologia Illumina pornește
de la fragmentarea ADN în secvențe de 200–600 de perechi de baze. Fragmentarea
este realizată de transpozom (complex transpozon–transpozază), care taie
ADN dublu catenar. Transpozomul* este utilizat în mutageneza inserțională și
este o secvență ADN cu capete libere care se inserează în ADN de interes, la
întâmplare, printr-un mecanism de „copy & paste“. Pentru că
transpozomul are capete libere, realizează atât fragmentarea, cât și adăugarea
de secvențe necesare pentru amplificare și secvențiere. De o parte și de alta a
fragmentelor rezultate se atașează secvențe denumite adaptor cu rol în etapa
următoare, de amplificare.
Etapa de fragmentare și amplificare (adaptat după Illumina Sequencing)
În timpul etapei de amplificare se adaugă secvențe: index,
terminale și complementare primerilor. Indexul este o secvență de șase perechi
de baze folosită pentru a identifica fragmentul de-a lungul experimentelor.
Astfel, se pot folosi aproximativ o sută de fragmente simultan, fiecare având
un index diferit. La final, sistemul de analiză computerizată va grupa toate
citirile bazându-se pe index. Secvența terminală se folosește pentru atașarea
fragmentului de ADN la nivelul plăcii de sticlă – denumită flow-cell. Pe
sticla acoperită cu acrilamidă se găsesc oligonucleotide complementare regiunii
terminale. Odată ce fragmentul ADN este adăugat pe flow-cell, acesta se
va atașa la oligonucleotidul complementar. Astfel, aceste oligonucleotide mențin
ADN la nivelul platformei în timpul secvențierii.
Odată atașat, urmează etapa de amplificare de tip punte („bridge“)
a catenelor de ADN cu scopul de a crea sute de copii ale catenelor originale și
ale celor complementare. ADN polimeraza sintetizează catena complementară celei
inițiale, pentru ca mai apoi aceasta din urmă să fie spălată. Catena nou
sintetizată are la capătul său un adaptor ce determină curbarea catenei pentru
a intra în contact cu oligonucleotidul complementar. Polimeraza se atașează la
nivelul catenei complementare și resintetizează catena originală. Această
amplificare de tip punte se desfășoară simultan pentru sute de mii de clustere
în același timp.
La finalul amplificării, catenele complementare sunt spălate,
rămânând numai cele originale. Primerii se vor atașa la această catenă ADN și
mai apoi sunt adăugate nucleotidele fluorescente. Fiecare nucleotid conține o
secvență finală ce împiedică adiția mai multor nucleotide în același timp. După
fiecare adiție, aparatul va detecta tipul de nucleotid după lungimea de undă
specifică fiecărui fluorocrom atașat. După citirea catenei ADN originale,
catena nou formată este spălată, primerul indexului 1 este adăugat și
polimerizează cu secvența index 1, pentru ca ulterior aceasta să fie
îndepărtată, fapt ce duce la deblocarea capătului 3’OH, curbarea catenei și atașarea
la oligonucleotidul complementar. Primerul indexului 2 se atașează,
polimerizează cu secvența index 2 și este spălat pentru ca ADN-polimeraza să
construiască catena complementară. Cele două catene rezultate sunt separate,
capătul 3’OH este blocat și catena originală îndepărtată. Catena complementară
va urma același proces de secvențiere prin sinteză ca și cea originală.
Etapa de amplificare de tip punte (bridge)
Analiza datelor se bazează pe gruparea fragmentelor ce se
suprapun, având în vedere că secvențierea se realizează în milioane de
clustere, fiecare conținând una-două mii de copii ale ADN-ului introdus.
Întrucât fragmentele în tehnica Illumina sunt scurte, regiunile de tip short
tandem repeats (STR) nu pot fi identificate cu ușurință. De asemenea, dacă
secvența ADN este nou descoperită și nu există o referință pentru comparare,
reconstruirea devine dificilă. Un alt dezavantaj al metodei este utilizarea
ADN-polimerazei, care poate introduce nucleotide greșite mai ales la nivelul
capetelor 3’OH, ceea ce generează secvențe incorecte.
*Hoffman LM et al. Transposome insertional
mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica.
2000;108(1):19-24
Abonează-te la Viața Medicală!
Dacă vrei să fii la curent cu tot ce se întâmplă în lumea medicală, abonează-te la „Viața Medicală”, publicația profesională, socială și culturală a profesioniștilor în Sănătate din România!
Cookie-urile ne ajută să vă îmbunătățim experiența pe site-ul nostru. Prin continuarea navigării pe site-ul www.viata-medicala.ro, veți accepta implicit folosirea de cookie-uri pe parcursul vizitei dumneavoastră.
