Secvențierea
genetică se referă la orice metodă ce determină succesiunea de nucleotide
dintr-o catenă ADN sau ARN. Metodele de secvențiere ale ADN sau ale ARN sunt
instrumente cheie în multe domenii, nu numai în cercetarea biomedicală; multe științe
beneficiază de pe urma acestora: medicina legală, arheologia, antropologia etc.
Secvențierea genetică a dus la dezvoltarea de noi concepte și la descoperirea
genelor implicate în afecțiuni considerate anterior idiopatice1.
Secvențierea
Sanger cu dideoxinucleotide. Prima metodă de secvențiere a fost dezvoltată
la sfârșitul anilor ʼ70 de Sanger și Coulson și se bazează pe o reacție de
polimerizare a fragmentelor de ADN complementare cu secvența template de
interes (ADN necunoscut)2. Un primer marcat cu fosfor
radioactiv (32P), oligonucleotid scurt, complementar cu secvența template,
este hibridizat la o regiune specifică cunoscută din ADN-ul de secvențiat,
creându-se astfel un punct de pornire pentru sinteza ADN. Într-o etapă
ulterioară, ADN-polimeraza realizează elongarea prin polimerizarea catalitică a
deoxinucleotidtrifosfaților (dNTP).
Practic,
elongarea primer-ului se face în prezența dNTP și a ddNTP
(dideoxinucleotidtrifosfat). Reacția se realizează în patru eprubete diferite,
fiecare conținând dATP, dGTP, dTTP, dCTP și un singur dideoxinucleotid.
Cantitatea de dideoxinucleotid este de peste o sută de ori mai mică în comparație
cu cea a deoxinucleotidelor. Încorporarea unui ddNTP duce la oprirea procesului
de elongare pentru că în structura sa lipsește grupul hidroxil (OH) de la
capătul 3’ , grup responsabil de formarea legăturii între două nucleotide;
ddNTP sunt marcate radioactiv pentru a fi detectate.
După
mai multe runde de elongare, în fiecare eprubetă se generează o colecție de
catene ADN nou sintetizate, de dimensiuni diferite. Urmează apoi separarea
catenelor nou sintetizate în funcție de dimensiune. Se folosește electroforeza
în gel de poliacrilamidă, în care, datorită faptului că moleculele de ADN sunt
încărcate negativ, la aplicarea unui curent pozitiv acestea vor migra în câmpul
electric creat în funcție de dimensiuni; cele mici migrează mai departe în gel,
iar cele mari mai puțin. Vizualizarea catenelor nou sintetizate se realizează
prin autoradiografie. Principiul metodei Sanger prin utilizarea de
dideoxinucleotide este schematizat în fig. 1.
Fig. 1 – Principiul secvențierii prin metoda Sanger (adaptat după Anna Kaksone, Tempere University of Technology)
O
variantă a metodei Sanger utilizează ddNTP marcați fluorescent. Fiecare dintre
cei patru ddNTP este marcat cu un fluorocrom diferit. Reacția se desfășoară
într-o singură eprubetă, iar fragmentele generate sunt separate prin
electroforeză. Ordinea nucleotidelor este citită de un laser, pentru ca
ulterior nucleotidele să fie reprezentate ca vârfuri pe cromatogramă (fig.
2).
Necesitatea
de a reduce costurile și de a scurta timpul de secvențiere a dus la dezvoltarea
tehnicilor de nouă generație (next generation sequencing – NGS). Cele
mai utilizate tehnici NGS sunt: Illumina, Roche 454-pirosecvențierea, Ion
torrent sequencing,Single molecule real-time sequencing (SMRT).
Despre principiile primelor trei metode vom scrie în edițiile viitoare ale
acestei rubrici.
Fig. 2 – Exemplu de cromatogramă ce rezultă în urma secvențierii Sanger Sursa: University of Chicago
Notă autor:
1. França LT et al. A review of DNA sequencing techniques. Q Rev Biophys. 2002 May;35(2):169-200
2. Sanger F et al. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 Dec;74(12):5463-7
Abonează-te la Viața Medicală!
Dacă vrei să fii la curent cu tot ce se întâmplă în lumea medicală, abonează-te la „Viața Medicală”, publicația profesională, socială și culturală a profesioniștilor în Sănătate din România!
Cookie-urile ne ajută să vă îmbunătățim experiența pe site-ul nostru. Prin continuarea navigării pe site-ul www.viata-medicala.ro, veți accepta implicit folosirea de cookie-uri pe parcursul vizitei dumneavoastră.
