Autentificare
Dacă ești abonat medichub.ro, autentificarea se face cu adresa de E-mail și parola pe care le utilizezi pentru a intra în platformă.
Abonează-te la „Viața medicală” ca să ai acces la întreg conținutul săptămânalului adresat profesioniștilor din Sănătate!
#DinRecunostinta
Căutare:
Căutare:
Acasă

Metode de secvențiere genetică (1)

Viața Medicală
Dr. Nicoleta-Monica FOTEA luni, 21 martie 2016
     Secvențierea genetică se referă la orice metodă ce determină succesiunea de nucleotide dintr-o catenă ADN sau ARN. Metodele de secvențiere ale ADN sau ale ARN sunt instrumente cheie în multe domenii, nu numai în cercetarea biomedicală; multe științe beneficiază de pe urma acestora: medicina legală, arheologia, antropologia etc. Secvențierea genetică a dus la dezvoltarea de noi concepte și la descoperirea genelor implicate în afecțiuni considerate anterior idiopatice1.
     Secvențierea Sanger cu dideoxinucleotide. Prima metodă de secvențiere a fost dezvoltată la sfârșitul anilor ʼ70 de Sanger și Coulson și se bazează pe o reacție de polimerizare a fragmentelor de ADN complementare cu secvența template de interes (ADN necunoscut)2. Un primer marcat cu fosfor radioactiv (32P), oligonucleotid scurt, complementar cu secvența template, este hibridizat la o regiune specifică cunoscută din ADN-ul de secvențiat, creându-se astfel un punct de pornire pentru sinteza ADN. Într-o etapă ulterioară, ADN-polimeraza realizează elongarea prin polimerizarea catalitică a deoxinucleotidtrifosfaților (dNTP).
     Practic, elongarea primer-ului se face în prezența dNTP și a ddNTP (dideoxinucleotidtrifosfat). Reacția se realizează în patru eprubete diferite, fiecare conținând dATP, dGTP, dTTP, dCTP și un singur dideoxinucleotid. Cantitatea de dideoxinucleotid este de peste o sută de ori mai mică în comparație cu cea a deoxinucleotidelor. Încorporarea unui ddNTP duce la oprirea procesului de elongare pentru că în structura sa lipsește grupul hidroxil (OH) de la capătul 3’ , grup responsabil de formarea legăturii între două nucleotide; ddNTP sunt marcate radioactiv pentru a fi detectate.
     După mai multe runde de elongare, în fiecare eprubetă se generează o colecție de catene ADN nou sintetizate, de dimensiuni diferite. Urmează apoi separarea catenelor nou sintetizate în funcție de dimensiune. Se folosește electroforeza în gel de poliacrilamidă, în care, datorită faptului că moleculele de ADN sunt încărcate negativ, la aplicarea unui curent pozitiv acestea vor migra în câmpul electric creat în funcție de dimensiuni; cele mici migrează mai departe în gel, iar cele mari mai puțin. Vizualizarea catenelor nou sintetizate se realizează prin autoradiografie. Principiul metodei Sanger prin utilizarea de dideoxinucleotide este schematizat în fig. 1.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 1 – Principiul secvențierii prin metoda Sanger
(adaptat după Anna Kaksone, Tempere University of Technology)
 
     O variantă a metodei Sanger utilizează ddNTP marcați fluorescent. Fiecare dintre cei patru ddNTP este marcat cu un fluorocrom diferit. Reacția se desfășoară într-o singură eprubetă, iar fragmentele generate sunt separate prin electroforeză. Ordinea nucleotidelor este citită de un laser, pentru ca ulterior nucleotidele să fie reprezentate ca vârfuri pe cromatogramă (fig. 2).
     Necesitatea de a reduce costurile și de a scurta timpul de secvențiere a dus la dezvoltarea tehnicilor de nouă generație (next generation sequencing – NGS). Cele mai utilizate tehnici NGS sunt: Illumina, Roche 454-pirosecvențierea, Ion torrent sequencing, Single molecule real-time sequencing (SMRT). Despre principiile primelor trei metode vom scrie în edițiile viitoare ale acestei rubrici.
Fig. 2 – Exemplu de cromatogramă ce rezultă în urma secvențierii Sanger
Sursa: University of Chicago
 
1. França LT et al. A review of DNA sequencing techniques. Q Rev Biophys. 2002 May;35(2):169-200

2. Sanger F et al. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 Dec;74(12):5463-7

Abonează-te la Viața Medicală

Dacă vrei să fii la curent cu tot ce se întâmplă în lumea medicală, abonează-te la „Viața Medicală”, săptămânalul profesional, social și cultural al medicilor și asistenților din România!
  • Tipărit + digital – 200 de lei
  • Digital – 129 lei
Titularii abonamentelor pe 12 luni sunt creditați astfel de:
  • Colegiul Medicilor Stomatologi din România – 5 ore de EMC
  • Colegiul Farmaciștilor din România – 10 ore de EFC
  • OBBCSSR – 7 ore de formare profesională continuă
  • OAMGMAMR – 5 ore de EMC
Află mai multe informații despre oferta de abonare.