Una dintre primele aplicații ale sistemului CRISPR/Cas9 a fost
în domeniul agriculturii, cu accent pe modificarea culturilor de orez și grâu.
Sistemul de editare a genomului a fost utilizat pentru a modifica specific
ADN-ul astfel încât culturile să devină mai rezistente la secetă sau boli.
Transmiterea caracterelor modificate se bazează pe variația genetică naturală
și pe back-crossing, ce presupune încrucișarea unui hibrid cu unul dintre
progenitorii săi pentru a da naștere unui produs cu o identitatea genetică mai
apropiată de cea parentală. În 2014, Wang a reușit, utilizând CRISPR/Cas9, să
elimine genele de la nivelul locusului MLO (ce conferă susceptibilitate la
contaminarea fungică) și să creeze o specie de grâu rezistentă la infecțiile
fungice (1).
CRISPR/Cas9 a fost adaptat de un cercetător de la Universitatea
din California pentru producerea de uleiuri prin intermediul drojdiei Yarrowia
lipolytica (2). Deși nu este prima încercare de a modifica această specie
de drojdie considerată neobișnuită, tehnologia TALEN nu s-a dovedit suficient
de eficientă pentru editarea genomică, însă prin CRISPR/Cas9 s-a modificat Y.
lipolytica astfel încât să producă hidrocarburi cu lanț lung, utilizate în
parfumuri, lacuri, adezivi, până acum obținute din petrol. Se urmărește, de
asemenea, obținerea unor precursori pentru uleiurile utilizate în gastronomie.
Generarea de modele animale ce imită diferite patologii umane a
reprezentat punctul de plecare pentru înțelegerea multor maladii, dar și un nod
gordian din cauza dificultății de a obține modele care să recapituleze cât mai
fidel patologia umană. Cu tehnicile anterioare, majoritatea mutațiilor obținute
erau la șoarece, formarea modelelor transgenice la maimuțe sau la alte primate
evoluate fiind fără succes, deși acestea ar permite un sistem mai bun pentru
testarea medicamentelor și studiul sistemului nervos. În domeniul
neuroștiințelor, crearea prin CRISPR/Cas9 a unor maimuțe ce dezvoltă autism,
schizofrenie sau Alzheimer, maladii ce nu pot fi modelate la șoareci,
conturează direcții noi de cercetare. Gouping Feng de la MIT a mutat SHANK3,
genă candidat pentru autism la o specie de maimuțe (3).
Terapia genică implică modificarea la nivel genomic a unui
defect genetic dobândit sau congenital. În 2014, utilizând ca model șoarecele,
s-a corectat gena asociată cu tirozinemia, boală metabolică ereditară (4), pentru
ca, în 2016, Long, prin editare genomică postnatală, să corecteze gena pentru
distrofină, proteină modificată în boala Duchenne (5). Grupul de cercetare
condus de Chiarle, la Harvard, a introdus la nivel intratraheal și
intrapulmonar CRISPR/Cas9 prin intermediul unui lentivirus la șoarecele adult
pentru a determina o translocație între genele EML4 și Alk. Această
translocație a dus la dezvoltarea unor tumori pulmonare la două luni de la
injectare (6).
Virusul HIV-1 își integrează ADN-ul în genomul gazdei prin
intermediul integrazei, enzimă ce utilizează secvențe de tip LTR (long
terminal repeats). Cu toate că există inhibitori ai integrazei cu puține
efecte adverse, infecția nu poate fi vindecată din cauza existenței unor
rezervoare virale în țesutul limfoid, sistemul nervos central, plămân, tractul
gastrointestinal sau cel genitourinar, care nu sunt afectate de terapia
actuală. Prin CRISPR/Cas9 s-a eliminat ADN-ul HIV-1 din limfocitele CD4+ pe
culturi de celule 2D10. Când aceste celule au fost ulterior expuse la infecția
virală, au fost protejate față de reinfecție (7). Această observație este
văzută ca un pas înainte către o terapie anti-limfocite T infectate cu HIV-1.
Numeroase companii farmaceutice au început recrutarea de
pacienți pentru fazele clinice ale unor terapii ce implică sistemul
CRISPR/Cas9. Editas Medicine și-a programat, pentru ianuarie 2017, debutul
fazei clinice a unei terapii ce vizează o formă rară de cecitate, cu mutație la
nivel mitocondrial, numită amauroza congenitală Leber. Corecția se va face la
nivelul unei proteine importante pentru dezvoltarea centrozomului și a cilului,
CEP290, anterior cunoscută ca LCA10. Compania farmaceutică Regeneron încearcă
să corecteze gena ATTR prin CRISPR/Cas9 la nivelul celulelor hepatice direcționat
prin nanoparticule lipidice.
În urmă cu doi-trei ani, utilizarea în epigenetică a dCas9 (dead
Cas9) cu molecule efector sau represor era o zonă de cercetare încă
observațională, fără multe studii experimentale, dar acum acest domeniu se
dezvoltă pe baza unor experimente ce folosesc modele celulare modificate prin
câștig sau pierdere de funcție la nivelul locusurilor de interes. Qi și
colaboratorii au propus utilizarea CRISPR pentru a inhiba expresia unor gene
arbitrare în celule umane sau bacteriene. Sistemul CRISPRi funcționează
independent de sistemele celulare în care se află și utilizează dCas9, proteină
care și-a pierdut funcția de nuclează și un fragment de ARN ghid (sgRNA) de 20
de perechi de baze complementar cu regiunea de interes. Coexpresia sgRNA cu
dCas9 reprimă eficient transcripția (la bacterii, de aproximativ trei sute de
ori) prin interferarea etapelor de elongație, atașare a ARN-polimerazei și a
factorului de transcripție. Prin această metodă, se investighează eventuale
gene supresoare tumorale sau genele esențiale pentru infectarea celulelor umane
de virusul hepatitei C (8).
O altă utilizare interesantă este vizualizarea unei regiuni
specifice de ADN pentru a înțelege mai bine organizarea sa spațio-temporală.
Aceasta se realizează prin fuziunea dCas9 cu proteina fluorescentă EGF (9).
Tehnica a fost extinsă pentru a permite colorații multiple (10).
Identificarea proteinelor ce se asociază la diferite regiuni din
genom este dificilă, dar, prin tehnica dezvoltată de laboratoarele Fuji, aceasta
a devenit posibilă prin metoda de imunoprecipitare a cromatinei (enCHIP).
Utilizând același principiu, s-a utilizat dCas9 atașată la o proteină-ghid
pentru a purifica diferite regiuni din genom. Apoi, prin spectrometrie de masă,
s-au identificat proteinele asociate cu regiunile de cromatină precipitate
(11).
Sistemul CRISPR/Cas9 se dovedește a fi un instrument cu înaltă
aplicabilitate în domenii diverse și cu un mare potențial în terapia genică a
unor boli care deocamdată pot fi cel mult controlate, nu vindecate.
Notă autor:
Bibliografie
1. Wang Y et al. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nat Biotechnol. 2014 Sep;32(9):947-51
2. Schwartz CM et al. Synthetic RNA polymerase III promoters facilitate high-efficiency CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Yarrowia lipolytica. ACS Synth Biol. 2016 Apr 15;5(4):356-9
3. Zhou Y et al. Mice with Shank3 mutations associated with ASD and schizophrenia display both shared and distinct defects. Neuron. 2016 Jan 6;89(1):147-62
4. Yin H et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 2014 Jun;32(6):551-3
5. Long C et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 2016 Jan 22;351(6271):400-3
6. Blasco RB et al. Simple and rapid in vivo generation of chromosomal rearrangements using CRISPR/Cas9 technology. Cell Rep. 2014 Nov 20;9(4):1219-27
7. Kaminski R et al. Elimination of HIV-1 genomes from human T-lymphoid cells by CRISPR/Cas9 gene editing. Sci Rep. 2016 Mar 4;6:22555
8. Chen S et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 2015 Mar 12;160(6):1246-60
9. Ma H et al. Multicolor CRISPR labeling of chromosomal loci in human cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Mar 10;112(10):3002-7
10. Chen B et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 2013 Dec 19;155(7):1479-91
11. Fujita T, Fujii H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem Biophys Res Commun. 2013 Sep 13;439(1):132-6
Abonează-te la Viața Medicală!
Dacă vrei să fii la curent cu tot ce se întâmplă în lumea medicală, abonează-te la „Viața Medicală”, publicația profesională, socială și culturală a profesioniștilor în Sănătate din România!
Cookie-urile ne ajută să vă îmbunătățim experiența pe site-ul nostru. Prin continuarea navigării pe site-ul www.viata-medicala.ro, veți accepta implicit folosirea de cookie-uri pe parcursul vizitei dumneavoastră.
