Subcultura,
denumită mai frecvent pasajul celulelor, constă în eliminarea
mediului din care s-au epuizat substanțele nutritive și transferul
acestora pe un alt mediu de cultură proaspăt, procedură ce permite
propagarea celulelor sau a liniilor celulare. O cultură celulară
trece prin mai multe faze ce descriu curba de creștere ideală a
celulelor în cultură;
etapa inițială este faza de lag, imediat după însămânțare,
urmată de faza logaritmică, în care celulele proliferează
exponențial. Atunci când celulele aderente ocupă tot substratul
disponibil sau, în cazul celulelor în suspensie, este epuizat
mediul de creștere, ritmul de proliferare se reduce, menținându-se
constant (faza de platou), sau încetează complet (faza de declin
rapid). Pentru a se menține creșterea optimă și a se stimula în
continuare proliferarea, se realizează pasajul celulelor.
Determinarea momentului în care se
realizează subcultura se bazează pe aceleași criterii, atât în
cazul celulelor aderente, cât și în cazul celor în suspensie.
Există însă importante deosebiri între culturile celulelor de
mamifere și de insecte.
Densitatea
celulară
Celulele
mamiferelor.
Culturile aderente trebuie pasate când se află în faza
logaritmică, înainte de a ajunge la confluență. Celulele normale
se opresc din creștere în momentul în care ating confluența,
proces numit inhibiție de contact. Dacă se pasează în momentul în
care se atinge confluența, celulele vor crește mai lent și își
pot modifica unele caracteristici fenotipice și genotipice. În mod
similar, și celulele în suspensie trebuie pasate în faza
logaritmică pentru că în mod contrar acestea se adună în
clustere.
Celulele
insectelor.
Culturile ce folosesc celule de insecte (de exemplu culturile deDrosophila
S2), folosite cel mai frecvent pentru expresia proteinelor heterologe
(expresia heterologă se referă la expresia unor gene într-un
organism gazdă ce nu exprimă în mod normal aceste gene), se
pasează, de asemenea, în faza logaritmică.
Consumarea
mediului de cultură
Scăderea pH-ului indică creșterea
concentrației de acid lactic, toxic și suboptim pentru creșterea
celulară. Schimbarea de pH este dependentă de densitatea celulară;
o scădere rapidă peste 0,1–0,2 unități de pH simultan cu
creșterea densității celulare indică necesitatea pasajului. Spre
deosebire de mamifere, celulele insectelor se cultivă într-un mediu
mai acid. Scăderea pH-ului este graduală la celulele insectelor
odată cu creșterea celulară.
Pasarea celulelor conform unei scheme
bine stabilite asigură un comportament reproductibil și permite
urmărirea statusului culturii. Densitatea de însămânțare se
variază până la obținerea unei rate de creștere optime pentru
tipul de celule folosit. Devierea de la pattern-ul de creștere
indică probleme precum: contaminare, temperatură suboptimală sau
mediu de cultură inadecvat. Se recomandă respectarea programului de
pasaj, a mediului de cultură, a procedurii de disociere, a ratei de
split (densitatea de însămânțare la pasaj) și a concentrației
de însămânțare.
Primul pas pentru pasarea celulelor
aderente la mediu este detașarea lor de pe suprafața de cultură
prin metode enzimatice sau mecanice. Printre metodele mecanice de
disociere se numără: agitarea plăcilor de cultură sau pipetarea
viguroasă (utilizată pentru celulele ce nu aderă ferm la substrat
sau pentru celulele mitotice), răzuirea (pentru celulele sensibile
la proteaze, cu mențiunea că uneori acest tip de detașare poate
afecta celulele). În cazul metodelor enzimatice, cele mai frecvent
utilizate enzime sunt: tripsina, tripsina + colagenoza, dispaza –
pentru celulele epiteliale, permițând detașarea în straturi, sau
alte enzime utilizate în situații speciale (celule foarte aderente,
culturi cu reactivi fără proveniență animală).
Pasarea
culturilor aderente
Pasarea unei culturi de celule
aderente urmează în general următorii pași, cu modificările
specifice tipului de celule utilizate (1):
1. Înlăturarea mediului din
recipientul de cultură.
2. Spălarea celulelor cu soluție
salină (frecvent utilizat este PBS). Adăugarea acesteia se face
delicat, pe un perete al recipientului, pentru a nu afecta stratul de
celule atașate, și apoi se distribuie pe toată suprafața prin
înclinare de câteva ori. Această etapă înlătură urmele de ser,
calciu sau magneziu care ar inhiba acțiunea agentului de disociere.
3. Înlăturarea soluției de
spălare.
4. Adăugarea agentului de disociere,
cel mai frecvent tripsină preîncălzită, pe un perete al vasului
de cultură; se adaugă cantitatea de agent necesară pentru
acoperirea stratului de celulele (această cantitate depinde de
suprafața vasului de cultură).
5. Incubarea pentru aproximativ două
minute la 21°C. Perioada de incubare variază în funcție de tipul
celular utilizat și trebuie verificată în tabele standardizate.
6. Examinarea la microscop a
celulelor după detașare. Dacă se detașează mai puțin de 90% din
celule, se mărește timpul de incubare cu câteva minute,
verificându-se disocierea la fiecare 30 de secunde. Procesul poate
fi accelerat și prin agitarea recipientului.
7. Când mai mult de 90% din celule
sunt detașate, se adaugă un volum de mediu de cultură de două ori
mai mare comparativ cu volumul utilizat pentru disociere. Se
pipetează de câteva ori pentru a se dispersa mediul pe întreaga
suprafață.
8. Se transferă celulele într-un
tub și se centrifughează. Viteza și timpul de centrifugare diferă
în funcție de tipul celular. În ceea ce privește viteza de
centrifugare, este bine de menționat că aceasta trebuie să fie
specificată în g (forță gravitațională) și nu în rpm (rotații
pe minut), întrucât forța aplicată este dependentă de diametrul
centrifugei – cu cât raza este mai mare, cu atât g crește.
9. Resuspendarea celulelor într-un
volum minim de mediu de cultură încălzit și recoltarea unui volum
pentru numărarea celulelor.
10. Determinarea numărului total de
celule și a procentului de viabilitate utilizând sisteme automate
sau numărarea manuală.
11. Diluarea suspensiei de celule
pentru a obține densitatea recomandată la însămânțare,
pipetarea volumului calculat în noi recipiente de cultură și
incubarea lor.
Pasarea
culturilor în suspensie
Pasarea celulelor aflate în
suspensie este mai puțin complicată decât pasarea celulelor
aderente. Întrucât celulele se află deja suspendate în mediul de
cultură, nu este necesară tratarea lor enzimatică pentru detașare
de pe suprafața plăcilor sau flask-urilor. Pasajul se realizează
direct prin diluarea celulelor sau prin înlăturarea unei părți
din aceste celule și aducerea celor rămase la densitatea dorită.
Frecvent, faza de lag ce urmează pasajului este mai scurtă decât
cea observată la celulele aderente.
Alegerea
mediului de cultură
Alegerea mediului de cultură este un
element important pentru obținerea unei culturi optime. Atunci când
o cultură nu se dezvoltă conform graficului ideal de creștere,
substratul și/sau mediul reprezintă primele două cauze
investigate. Alegerea mediului de cultură optim pornește de la
studiile anterioare pe tipul de celule utilizate. Însă o atenție
deosebită trebuie acordată acestor surse pentru că s-a observat o
tendință a cercetătorilor de a folosi mediile de cultură și
metodele de preparare ale colegilor de laborator, dar citarea în
articole a metodelor princeps publicate anterior mai degrabă decât
a celor folosite (2).
Componentele
mediului sunt la fel de importante. Se recomandă utilizarea apei
lipsită de endotoxine sau metale care pot afecta creșterea
celulelor. După adăugarea componentelor, mediul este echilibrat
prin adăugarea de NaHCO3
până la obținerea unui pH optim. Este utilă și determinarea
osmolarității, pentru că eventuale erori pot fi depistate în
această etapă prin modificarea acesteia.
Alte abateri
apar prin absența unui nivel optim de CO2
generat de sistemul tampon bazat pe bicarbonat. Acesta modifică
pH-ul, care afectează atașarea și creșterea. Cu cât cantitatea
de NaHCO3
este mai mare, cu atât nivelul de CO2
trebuie să fie mai ridicat. Cel mai cunoscut mediu tampon este EBSS,
cu 2,2 g/l NaHCO3,
creat pentru recipiente deschise care permit schimbul de gaze, precum
plăci, flask-uri cu un capac lax (1). Al doilea sistem tampon
frecvent utilizat este HBS, ce conține 0,35 g/l NaHCO3.
Acesta a fost creat pentru sisteme închise de cultură. Uneori, în
medii se adaugă și alte substanțe, precum HEPES, pentru că mențin
mai bine pH-ul în ciuda variațiilor de CO2,
cu toate că s-a evidențiat o toxicitate a acestuia în culturi după
expunerea la lumină ambientală prin producerea de peroxid de
hidrogen.