Autentificare
Dacă ești abonat medichub.ro, autentificarea se face cu adresa de E-mail și parola pe care le utilizezi pentru a intra în platformă.
Abonează-te la „Viața medicală” ca să ai acces la întreg conținutul săptămânalului adresat profesioniștilor din Sănătate!
#DinRecunostinta
Căutare:
Căutare:
Acasă  »  EDUCAȚIE  »  Ars Medici

Premiul Nobel pentru Chimie 2020 și editarea genomică în bolile hematologice

Viața Medicală
Dr. Radu GOLOGAN vineri, 11 decembrie 2020

Pentru prima dată în istoria știinţei, premiul Nobel a fost acordat simultan pentru doi cercetători de sex feminin și atât de repede după ce a fost făcută descoperirea pe care o premiază.

Mai mult, este de subliniat intervalul scurt de timp dintre momentul descoperirii de bază și cel al aplicării sale în numeroase domenii de cercetare știinţifică fundamentală și aplicată (1,2).

Premiul Nobel pentru biochimie a fost acordat anul acesta cercetătoarelor
dr. Emmanuelle Charpentier (Franţa), medic bacteriolog, și lui Jennifer Doudna (SUA), biochimist, pentru „dezvoltarea unei metode de editare a genomului”.

f1_1

Editarea genomică (EG) (genome editing/engineering) este definită ca modificarea deliberată a materialului genetic al unui organism, urmată, în esenţă, de câștig sau pierdere de funcţie a genelor implicate.

Iniţiată încă din anii ’80, când se baza doar pe hibridarea omoloagă, EG a cunoscut un progres substanţial odată cu folosirea, începând cu anul 2000, a nucleazelor chimerice cu specificitate înaltă pentru locus, capabile să producă rupturi în ADN-ul dublu-catenar.

Această descoperire a crescut eficienţa procedurii de câteva zeci de mii de ori, dar cu limitările impuse de o exigenţă tehnică ridicată și cu un cost ridicat – și, ca urmare, cu o aplicabilitate redusă în diversele laboratoare de biologie moleculară (3).

O adevărată „revoluţie” în domeniu s-a produs în 2012 (E. Charpentier și J. Doudna) prin introducerea sofisticatei tehnologii CRISPR-Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats, associated Cas9 – grupuri de [secvenţe] scurte palindromice repetate regulat interspaţiate, asociate cu enzima Cas9).

Aceasta este bazată tot pe nucleaze, ca proteine efectoare, dar s-a dovedit mult mai flexibilă, mai rapidă, mai simplă din punct de vedere tehnic, reproductibilă și cu un cost considerat mai accesibil. CRISPR a apărut ca un instrument care le permite cercetătorilor să editeze gene foarte precis, ușor și rapid (în zile, și nu în luni, ca prin metodele anterioare) (2,3).

Funcţionalitatea și structura CRISPR-Cas9

Fără a aborda complexitatea sistemului CRISPR-Cas9, care depășește scopul acestui material, este util a prezenta succint câteva date despre structura și funcţionalitatea sa.

Sistemul biomolecular CRISPR-Cas reprezintă o structură complexă existentă în genomul celulelor procariote (de exemplu, bacterii), în mod natural, în scopul protecţiei faţă de reinfecţia cu diverse virusuri sau prin transferul de plasmide. În celulele eucariote, sistemul este introdus în mod artificial, în scopul editării genomice.

f2_1
Fig. 1. Structura schematică a sistemului CRISPR-Cas. tracrRNA: ARN transactivant (ghid).Reprodus din (4)

El este alcătuit la procariote din patru componente principale (Fig. 1):
1) secvenţe de ADN scurte palindromice, care se pot „citi” în ambele sensuri (Fig. 2), repetate în mod regulat;

figura copy
Fig. 2. Exemplu de secvenţă palindromică. Secvenţele colorate gri sunt
netranscriptibile. Reprodus din Wikimedia Commons.

 

2) secvenţe de acizi nucleici denumite „distanţieri” (spacers), având originea în genomul virusului invadant al bacteriei, și care nu se repetă;

3) secvenţe de ARN-ghid (gRNA), care transcriu distanţierii după identificarea acestora, cu ajutorul „motivelor adiacente distanţierului”, denumite PAM (protospacer adjacent motif), acestea fiind secvenţe foarte scurte de ADN ce indică locusul iniţierii transcripţiei;

4) endonucleaze CRISPR-asociate (Cas), de exemplu Cas9, sintetizate de un complex de gene care se cuplează cu ARN-ghid, fiind ghidate de acesta la locul unde va secţiona ca un foarfece catenele ADN ale virusului invadant, neutralizându-l.

Cas9 este considerată „programabilă”, calitate derivată din legarea ei de molecule de ARN-ghid diverse (3,4). O ilustrare a modului de funcţionare a CRISPR-Cas la bacterii apare în figura 3.

f3
Fig. 3. Funcţionarea CRISPR la bacterii. crRNA: CRISPR-ARN. Reprodus din Wikimedia
Commons.

 

La eucariotele supuse EG sunt prezente doar ultimele două componente, reunite în complexul Cas9-gRNA, care acţionează după transcrierea PAM din ADN-ul genomic, acesta indicând locul de intervenţie a nucleazei
(Fig. 4).

f5
Fig. 4. Prezentare schematică a modului de acţiune a complexului gRNA-Cas în eucariotelesupuse editării genomice. Reprodus din (4)

 

Rupturile în catenele ADN secţionate sunt reparate folosind sistemul de reparare a celulei, continuitatea catenelor fiind refăcută prin secvenţe omoloage sau neomoloage de ADN.

În această etapă pot fi introduse (inserted), eliminate (deleted), inactivate (silenced) sau modificate (până la un singur nucleotid) diverse gene, folosind fie molecule de ARN-ghid sintetice, fie secvenţe de ADN-matrice (template), „confecţionate” în funcţie de scopul urmărit în procesul de editare și introduse în celulă prin diverse metode (5,6) (Fig. 5).

f6
Fig. 5. Ilustrare a procesului de reparare a rupturilor în catenele protospacer adjacent motif sequence, analog PAM; DSB: double-non-homologous end joining (refacere nonomoloagă a catenei omoloagă a catenei de ADN); Indel: inserţii/deleţii. Reprodus din (5)

 

Altfel spus, bacteriile utilizează sistemul CRISPR-Cas pentru a-și „aminti” de un anume virus care le atacă, fenomenul fiind intens studiat de bacteriologii geneticieni, cărora le este bine cunoscut.

Meritul laureaţilor Nobel și al altor cercetători din epocă nu a fost acela de a descoperi CRISPR-Cas, ci acela de a fi introdus în celulele eucariote (animale și umane) complexul CRISPR-Cas, pe care l-au adaptat și îmbunătăţit în scopul aplicării în EG, respectiv pentru a modifica (elimina, substitui, corecta, modela) diverse gene mutante sau nemutante din structura ADN, ori de a insera gene terapeutice în anumite sedii specifice. A fost astfel pusă la punct o tehnologie de EG performantă, bazată pe endonucleaze programabile (5,6).

Interesul pentru tehnologia CRISPR-Cas a crescut rapid în lumea știinţifică. Astfel, dacă în 2012 erau publicate cu acest subiect numai 126 de articole, în 2016 erau deja 2.155 (1).

Totodată, câmpul larg de aplicaţii pentru cercetare în variate domenii precum medicina, genetica, agricultura, zootehnia, industria alimentară, industria farmaceutică, crearea de modele de animale de laborator, xenotransplantare, biotehnologia spaţială și multe altele a stimulat o efervescentă preocupare pe plan industrial.

Această largă aplicabilitate a impus și elaborarea unor reguli controlabile – de etică în aplicarea tehnologiei și de siguranţă a pacientului și consumatorului –, printre care interzicerea totală a utilizării pe celule embrionare (7-9). Exemple de domenii de aplicabilitate a CRISPR sunt prezentate în figura 6.

f7
Fig. 6. Exemple de aplicaţii potenţiale ale CRISPR-Cas9.Reprodus din (5)

 CRISPR-Cas9 în bolile hematologice

În domeniul patologiei umane, bolile hematologice ereditare au fost considerate ţinte ideale pentru terapia genică cu ajutorul CRISPR-Cas9. Aceasta deoarece pentru remiterea simptomatologiei acestor boli este cel mai adesea suficientă refacerea doar parţială a funcţiei genelor deficiente (5,10).

Cercetări promiţătoare bazate pe această tehnologie, sintetizate în figura 7, au fost efectuate pe linii celulare sau/și pe animale de laborator în hemopatii atât ereditare, cât și neoplazice maligne, în ß- talasemie, siclemie, anemia Fanconi, anemia Diamond-Blackfan, hemofilia A și B și boala granulomatoasă cronică.

f8
Fig. 7. Posibile aplicaţii ale CRISPR-Cas9 în bolile hematologice. iPSCs: induced pluripotent stem cells (celule stem pluripotente reprogramate); HSPC: cellule stem hematopoietice pluripotente. Reprodus din (10)

 

De asemenea, ea a fost utilizată în studiul hemopatiilor maligne precum limfoamele non-Hodgkin, îndeosebi în limfomul mantalei, bolile mieloproliferative cronice JAK2-pozitive, mielomul multiplu, leucemia acută mieloidă (5,10).

Primul trial în care s-a utilizat tehnologia CRISPR într-o boală neoplazică malignă în SUA a fost iniţiat în 2019, la doi pacienţi diagnosticaţi cu mielom multiplu, și este în curs de desfășurare (11,12).

În hemofilia B s-a obţinut o corecţie a nivelului de Factor IX pentru o perioadă de cel puţin opt luni la șoarecii nou-născuţi și adulţi la care s-a introdus CRISPR-Cas9, cu ajutorul unui vector adenoviral (AAV8), creându-se astfel premizele pentru o alternativă de EG care s-o înlocuiască sau s-o completeze pe cea aprobată și folosită în prezent la om, și care are aplicabilitate redusă la pacienţii pediatrici (13,14).

În iunie 2020 au fost raportate primele rezultate parţiale ale unor trialuri de fază 1 sau 2 iniţiate în 2019 în hemoglobinopatii (doi pacienţi cu talasemie majoră și unul cu siclemie), de către companiile CRISPR Therapeutics din Elveţia și Vertex Pharmaceuticals Inc. din SUA, aflate în colaborare.

În talasemie s-a obţinut o independenţă de transfuzii persistentă la 15 luni de la administrarea produsului obţinut prin CRISPR, denumit CTX001, cu valori normale ale hemoglobinei totale.

În siclemie s-a obţinut dispariţia crizelor dureroase veno-ocluzive și normalizarea valorilor hemoglobinei. Dinamica creșterii nivelului de HbF la pacienţi cu talasemie și siclemie după infuzarea produsului CTX001 este prezentată în figura 7.

CTX001 este un produs de terapie genomică pentru talasemie și siclemie aflat în stadiul investigaţional, dar care a primit recent
statutul de PRIME („medicament promiţător”) acordat de Agenţia Europeană a Medicamentului, și de medicament „orfan” acordat de către FDA.

El constă din celule stem hematopoietice ale pacientului editate genic ex vivo prin metodologia CRISPR-Cas9 pentru a produce niveluri ridicate de hemoglobină fetală (F) transportatoare de oxigen, celule care sunt reinfuzate pacientului (etapă denumită „autogrefare”) (15).

În cadrul hemopatiilor maligne, aplicarea la om a fost făcută până în prezent doar în mielomul multiplu. S-a folosit tehnologia CRISPR-Cas9 ex vivo pe limfocitele T ale pacientului atât pentru modificarea genetică a receptorului limfocitelor T (TCR-engineered T-cell therapy), care devine capabil să atace celulele mielomatoase, cât și pentru îndepărtarea genelor care împiedică limfocitele T să atace celulele-ţintă.

Limfocitele T editate au fost apoi reinfuzate pacientului după un tratament de condiţionare. Deși fără un beneficiu terapeutic pentru pacienţi, tentativa a demonstrat buna toleranţă și lipsa imunogenităţii celulelor T editate.

De asemenea, CRISPR-Cas9 a fost folosită și pentru obţinerea de produse de imunoterapie celulară mai performante, realizate prin biotehnologia CAR-T (chimeric antigen receptor T lymphocytes) (11,12,16).

Dacă aplicaţiile tehnologiei CRISPR în patologia clinică umană sunt încă foarte la început și limitate, cercetările experimentale bazate pe această tehnologie, care vizează o mai bună cunoaștere a bolilor hematologice și a etiopatogeniei acestora, sunt numeroase, ele deschizând perspective largi pentru terapia personalizată (17).

Limite și provocări actuale în aplicarea clinică a CRISPR-Cas9

EG bazată pe CRISPR-Cas9 este considerată cea mai revoluţionară descoperire știinţifică a ultimelor două decade, ea suscitând, îndeosebi din 2015, un interes crescând în lumea știinţifică și nu numai, datorită potenţialului imens pe care îl oferă. Totuși, aplicarea ei în medicina practică este încă în curs de dezvoltare.

Trebuie menţionat că nu există în prezent un procedeu terapeutic bazat pe tehnologia CRISPR-Cas9 aprobat de către forurile abilitate naţionale sau ale Uniunii Europene pentru utilizare la om (2), din cauza unor obstacole și provocări deloc neglijabile.

De exemplu, proprietăţile mijloacelor care asigură accesul la locusurile-ţintă ale componentelor necesare editării au un rol critic, iar alegerea acestora este un proces care se îmbunătăţește continuu.

Rupturi ale ADN-ului dublu catenar pot avea loc și în afara locusului-ţintă
(off-target sites), cu consecinţe funcţionale patologice imprevizibile sau cu generarea de mutaţii cauzate de unele deleţii ample sau rearanjări genice.

Celulele stem hematopoietice editate ar putea avea potenţialul de a-și extinde clonalitatea și de a genera leucemie. Un proces suboptimal de reparare a ADN-ului, o conversie insuficientă a ţintei sau producerea unor mutaţii cu efect negativ ireversibil pot împiedica atingerea pragului optim de modificare genomică necesar pentru îndepărtarea defectului genetic.

Reacţia sistemului imun faţă de reactivii necesari editării, precum anticorpii anti-Cas9, care pot exista la subiecţii care au avut infecţii cu stafilococul auriu sau cu streptococul piogen, constituie un obstacol major. Activarea genei p53, fenomen constatat recent, poate sta la originea unor eșecuri în EG sau/și a apariţiei unor transformări neoplazice maligne (5,9).

Rezultă că sunt necesare eforturi susţinute de cercetare pentru înţelegerea cât mai completă a efectelor genomice a aplicării tehnologiei CRISPR-Cas9 in vivo, deoarece riscul unor efecte nedorite ale modificării genelor creează reticenţă privind utilizarea terapeutică a acesteia la om.

În concluzie, abrevierea CRISPR-Cas9 denumește în prezent o tehnologie de EG de ultima generaţie considerată a avea aplicaţii foarte promiţătoare în patologia umană, în general, și în cea hematologică, în special.

Ea se află deocamdată în stadiu experimental, făcând însă obiectul unei intense activităţi de cercetare pe plan mondial, cu speranţa unei aplicabilităţi terapeutice cu rezultate superioare celor existente, și în condiţii de siguranţă pentru pacient.

Bibliografie
1. The Royal Swedish Academy of Science. The Nobel Prize for Chemistry 2020, Oct. 2020
2. Abbott A. The quiet revolutionary: How the co-discovery of CRISPR explosively changed Emmanuelle Charpentier’s life. Nature 2016, 532:432
3. Richter C. et al. Function and Regulation of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR Associated (Cas) Systems. Viruses 2012,4:2291
4. Jiang F., Doudna J.A. CRISPR–Cas9 Structures and Mechanisms. Annu. Rev. Biophys. 2017,46:505
5. Gonzalez-Romero E. et al. CRISPR to fix bad blood: a new tool in basic and clinical hematology. Haematologica 2019,104(5):881
6. Porteus M.H. A New class of medicines through DNA editing. N Engl J Med 2019,380:947
7. Butler J. R., Tector A. J. CRISPR genome-editing: A medical revolution. J Thorac Cardiovasc Surg 2017;153:488
8. Mittal R.D. Gene Editing in Clinical Practice: Where are We? Indian J Clin Biochem. 2019; 34(1):19
9. Daley G.Q. et al. After the Storm — A Responsible Path for Genome Editing. N Engl J Med 2019, 380(10):897
10. Zhang H., McCarty N. CRISPR-Cas9 technology and its application in haematological disorders. Br J Haematol. 2016; 175(2): 208
11. Stadtmauer E.A. et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science 2020, Doi 10.1126/science.aba7365.
12. Figueredo M. CRISPR-edited T-cells Safely, Effectively Target Cancer Cells in Myeloma Patients, Early Phase 1 Data Suggests. Myeloma Research News 13.11.2019
13. Wang L. et al. CRISPR/Cas9-mediated in vivo gene targeting corrects hemostasis in newborn and adult factor IX–knockout mice. Blood. 2019;133(26):2745
14. Pipe S.W., Selvaraj S.R. Gene editing în hemophilia: a “CRISPR” choice? Blood 2019,133(26):2733
15. CRISPR Therapeutics and Vertex announce new clinical data for investigational gene-editing therapy CTX001™ in Severe Hemoglobinopathies at the 25th Annual European Hematology Association (EHA) Congress. 12.06.2020
16. Couzin-Frankel J. CRISPR takes on cancer. Science2020:367(6478):616
17. Cavallo J. How CRISPR-Cas9 gene editing may improve the effectiveness of cellular therapeutics in patients with cancer. 2020, ASCO Post, 25.04.

Etichete: boli hematologice talasemie premiul nobel Emmanuelle Charpentier Jennifer Doudna editare genomica biochimie adn sistemul CRISPR-Cas siclemie terapie genomica


Abonament VM 600x600-01 v3b

Abonează-te la Viața Medicală

Dacă vrei să fii la curent cu tot ce se întâmplă în lumea medicală, abonează-te la „Viața Medicală”, săptămânalul profesional, social și cultural al medicilor și asistenților din România!
Până la 31 ianuarie 2021, ai reducere la prețul abonamentului pe 12 luni și ceva în plus:
  • Tipărit + digital – 160 de lei
  • Digital – 103 lei
Titularii abonamentelor pe 12 luni sunt creditați astfel de:
  • Colegiul Medicilor Stomatologi din România – 5 ore de EMC
  • Colegiul Farmaciștilor din România – 10 ore de EFC
  • OBBCSSR – 7 ore de formare profesională continuă
  • OAMGMAMR – 5 ore de EMC
Află mai multe informații despre oferta de abonare.